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AAT 最新研發:Transfectamine 5000轉染試劑操作建議

 

 

      Transfectamine 5000轉染試劑是美國AAT Bioquest生產的轉染試劑,Transfectamine 5000轉染試劑是一種功能強大且用途廣泛的轉染試劑,可將核酸引入真核細胞,引入動物細胞。它可以有效地將各種有效載荷轉染到各種粘附和懸浮細胞系中。它可用于質粒DNA轉染以及基于siRNA和shRNA的基因敲低實驗和基因表達研究。它在包括難于轉染的細胞在內的各種貼壁和懸浮細胞系中始終提供高轉染效率。Transfectamine 5000的低毒性也使轉染細胞具有更高的生存能力。與大多數其他轉染試劑相比,Transfectamine 5000更易于使用,并且不需要特殊的介質。

圖1.使用Transfectamine 5000,Lipofectamine 2000和Lipofectamine 3000試劑在HeLa細胞中的轉染效率比較。 每種試劑用于以96孔格式轉染HeLa細胞,轉染后24小時分析GFP表達。 與Lipofectamine 2000和Lipofectamine 3000試劑相比,Transfectamine 5000轉染試劑可提供更高的GFP轉染效率。

 

細胞脂質轉染機制

      細胞脂轉染,有時也稱為“脂質轉染”,是利用脂質復合物通過內吞作用或融合作用將核酸或蛋白質輸送到細胞中的方法。 由于程序效率會因細胞系,生物有效載荷細胞毒性和其他因素而有很大差異,因此有必要進行大量優化。

 

脂質轉染過程建議

1.細胞系優化

1.1 確定細胞系轉染抗性

1.2 建議查看舊版的操作方案,因為它含有更多細胞系兼容性的內容

1.3 懸浮細胞通常需要比貼壁培養更高的密度

 

2.DNA的純度與質量

2.1 DNA純度和質量比較DNA /試劑濃度以獲得最佳性能

2.2 細胞混合前測試DNA和試劑的不同孵育時間

2.3 內毒素水平應保持盡可能低

2.4 1.7-1.9的A260 / A280是大多數程序的理想純度

 

3.細胞融合與健康

3.1初步的細胞活力測定以確定細胞健康

3.2建議將大多數細胞系匯合至70-90%

3.3減少所需試劑以保持低毒性

3.4實驗前24小時準備細胞培養以達到最佳狀態

 

操作步驟

1.準備細胞進行轉染 培養細胞至約90%融合并使用新鮮,干凈的生長培養基

2.準備Transfectamine 5000-DNA混合物

2.1首先將2.5 ug DNA與200 uL無血清培養基混合。

2.2將7.5 uL解凍的Transfectamine 5000添加到DNA /培養基混合物中。

2.3充分混合并在室溫下孵育20分鐘。

3.將Transfectamine 5000-DNA混合物添加到細胞培養物中

4.過夜培養

5.用適當的方法分析轉染效率

5.1轉染后72-96小時可識別最大表達水平

5.2如果使用流式細胞儀,激光掃描分子成像,顯微鏡或蛋白質印跡分析,則建議使用熒光標記

 

常見問題

1.死細胞/不健康細胞解決方案

1.1在不使用試劑的情況下對DNA進行額外的控制:表達的蛋白質可能具有毒性

1.2檢查是否有污染并根據需要進行處理,或者使用新的培養液進行實驗

1.3選擇抗生素可能太強或添加太早。 以更低的濃度和更長的間隔再次測試

 

2.轉染料率低解決方案

2.1試劑可能沒有正確存儲。 檢查以確保沒有發生意外的重新凍結

2.2DNA質量或數量可能不足。 根據經驗確定合適的脂質與DNA的比例

2.3細胞培養基可能被血清或抗生素污染。 確保培養基不含生長促進劑或其他添加劑

 

用流式細胞儀確定轉染效率

1.使用未轉染的對照,并從實驗結果中減去基線強度數據

2.信號強度圖是比較細胞系對不同轉染試劑反應的簡單視覺輔助工具

3.許多儀器都有帶有FACS分析程序的軟件,可快速獲得結果



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