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凝膠電泳

凝膠電泳是生命科學研究中常規用于分離和分析帶電大分子的核心分子技術。通過對凝膠介質施加電場，可以根據其大小、電荷或構象分離和純化蛋白質和核酸片段等大分子。雖然通常作為 PCR 后的分析程序進行，但凝膠電泳方法也為印跡、克隆、DNA 測序和其他各種下游應用的制備取得了很大成功。

 

凝膠電泳原理

如前所述，凝膠電泳涉及使用電場根據大小、電荷或構象分離蛋白質和核酸片段。該場通常在電泳室（例如硬塑料罐）中產生，通常稱為凝膠盒（圖 1）。

圖1. 凝膠電泳工作流程說明

凝膠盒是一種裝有緩沖液的容器，一端為陰極（負極），另一端為陽極（正極），外接電源。凝膠作為抗對流和篩分介質，首先浸入緩沖液中，其孔靠近陽極。然后使用移液器將樣品裝入凝膠孔中。當外部電源打開時，向緩沖液施加電場，使帶電分子通過凝膠向相反的終端（即，向陽極）移動。根據分子的大小，它將以不同的速率和距離穿過基質。較小的分子將比較大的分子更快地通過凝膠基質遷移，最短的分子移動得最遠。

 

凝膠電泳的類型

兩種最常見的凝膠電泳方法包括用于分離核酸的瓊脂糖凝膠電泳和用于分離蛋白質和 500 個堿基對或更少的核酸片段的聚丙烯酰胺凝膠電泳 (PAGE)。下表總結了瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠電泳之間的主要區別。

表1. 瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠電泳之間的主要區別總結

電泳方法 瓊脂糖凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳
凝膠類型 瓊脂糖 聚丙烯酰胺
凝膠成分 瓊脂糖是從海藻中提取的多糖。凝膠含有長鏈相互連接的糖，形成網狀結構。 聚丙烯酰胺是通過腈水合酶消化丙烯腈制成的合成樹脂。凝膠是通過丙烯酰胺和雙丙烯酰胺化學交聯產生分子篩而制成的。
凝膠澆注法 凝膠在冷卻時凝固。瓊脂糖粉在緩沖液中混合并微波處理。然后將混合物倒入凝膠框架中并使其凝固。 一旦發生交聯，凝膠就會通過化學反應凝固。
孔隙特性 濃度決定孔徑。隨著濃度的增加，孔徑變小。 （典型濃度為 0.5-2%）。 丙烯酰胺與雙丙烯酰胺的比例決定了孔徑。 （典型濃度為6-15%）
凝膠運行方向 凝膠水平運行。 凝膠垂直運行。
應用 分離長度為 50-20,000 個堿基對的核酸片段。 分離長度為 5-500 個堿基對的蛋白質和核酸片段（例如，寡核苷酸、miRNA、tRNA 等）。
優點
  • 無毒凝膠介質
  • 凝膠易于澆鑄和快速凝固
  • 適用于分離大 DNA 分子，如 PCR 產物和雙鏈 DNA
  • 可以通過熔化凝膠、用酶瓊脂糖消化或用離液鹽處理從凝膠中回收樣品
  • 穩定的化學交聯凝膠
  • 孔徑大小均勻
  • 分辨率高，條帶清晰
  • 適用于分離低分子量片段，如單鏈 DNA
缺點
  • 瓊脂糖很貴
  • 分辨率較低，條帶模糊
  • 低分子量碎片分離不佳
  • 孔徑不均勻
  • 有毒單體（即丙烯酰胺是一種有效的神經毒素）
  • 凝膠制備繁瑣且容易泄漏
  • 每個實驗都需要新的凝膠

 

分離后的 DNA 樣本檢測

通過電泳分離后，可以使用幾種不同的方法觀察核酸片段。最廣為人知的使核酸片段可視化的方法是用溴化乙錠 (EtBr) 染色。然而，因為 EtBr 具有高度致癌性、細胞毒性和致突變性。它對環境有害，必須小心處理和處置。 EtBr 的更安全替代品包括新型凝膠染色劑，例如 Gelite Safe *10,000X Water Solution*、Gelite Safe *10,000X DMSO Solution*、Helixyte Green 和 Helixyte Gold，以及凝膠染色試劑盒，例如 Gelite Green Nucleic酸性凝膠染色試劑盒和 Gelite Orange 核酸凝膠染色試劑盒。這些凝膠染色劑和試劑盒不僅比 EtBr 的致突變性更小，而且 Gelite Safe、Helixyte Green、Helixyte Gold 和 Gelite 核酸染色試劑盒可以檢測瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠中的核酸，靈敏度更高，背景更少干涉。



Gel Stain Comparison
圖2. 使用 Gelite Safe、EtBr 和 SYBR® Safe 在 TBE 緩沖液中的 1% 瓊脂糖凝膠中檢測 DNA 的比較

表2.用于瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠電泳的核酸染色試劑

產品名稱 Ex (nm) 濾波片 規格 貨號
Cyber Green 核酸凝膠染料 10000X DMSO 254 mn Long path green filter 1 mL 17590
Cyber Green 核酸凝膠染料 [相當于 SYBR® Green] *10,000X DMSO 溶液* 254 mn Long path green filter 100 µL 17604
Cyber Orange 核酸凝膠染料 10000X DMSO 254 mn Long path green filter 1 mL 17595
Gelite 綠色核酸凝膠染色試劑盒 254 nm or 300 nm Long path green filter 1 Kit 17589
Gelite 橙色核酸凝膠染色試劑盒 254 nm or 300 nm Long path green filter 1 Kit 17594
Gelite Safe核酸凝膠染料* 10,000X水溶液* 254 nm, 300 nm or 520 nm Ethidium Bromide, Gel Star, Gel Green, Gel Red and SYBR filters 100 µL 17700
Gelite Safe核酸凝膠染料* 10,000X水溶液* 254 nm, 300 nm or 520 nm Ethidium Bromide, Gel Star, Gel Green, Gel Red and SYBR filters 500 µL 17701
Gelite Safe核酸凝膠染料* 10,000X水溶液* 254 nm, 300 nm or 520 nm Ethidium Bromide, Gel Star, Gel Green, Gel Red and SYBR filters 1 mL 17702
Gelite Safe核酸凝膠染料* 10,000X水溶液* 254 nm, 300 nm or 520 nm Ethidium Bromide, Gel Star, Gel Green, Gel Red and SYBR filters 10 mL 17703
Gelite Safe核酸凝膠染料* 10,000X DMSO溶液* 254 nm, 300 nm or 520 nm Ethidium Bromide, Gel Star, Gel Green, Gel Red and SYBR filters 100 µL 17704
Gelite Safe核酸凝膠染料* 10,000X DMSO溶液* 254 nm, 300 nm or 520 nm Ethidium Bromide, Gel Star, Gel Green, Gel Red and SYBR filters 500 µL 17705
Gelite Safe核酸凝膠染料* 10,000X DMSO溶液* 254 nm, 300 nm or 520 nm Ethidium Bromide, Gel Star, Gel Green, Gel Red and SYBR filters 1 mL 17706
Gelite Safe核酸凝膠染料* 10,000X DMSO溶液* 254 nm, 300 nm or 520 nm Ethidium Bromide, Gel Star, Gel Green, Gel Red and SYBR filters 10 mL 17707

 

分離后的蛋白質樣品檢測

對于蛋白質，可以使用產生顏色的化學反應或染料結合的方法來實現可視化。確定使用哪種方法在很大程度上取決于實驗條件和預期的下游應用。檢測凝膠中蛋白質的常用策略包括考馬斯染料染色、銀染色、鋅染色和熒光染料染色。雖然考馬斯染料和銀染色方法在總蛋白質分析中仍然很受歡迎，但熒光染料染色方法提供了更高的靈敏度和線性動態范圍。

表3.凝膠蛋白染色方法總結

染料類型 靈敏度范圍 操作時間 檢測方法 兼容的下游應用 特點
考馬斯染料 5 - 25 ng 10 - 135 minutes
  • 比色法
  • 質譜
  • 測序
  • 蛋白質印跡
  • 快速簡便的染色方案
  • 可逆
銀染 0.25 - 0.5 ng 30 - 120 minutes
  • 比色法
  • 質譜
  • 最穩定和靈敏的比色法
  • 方案需要幾個步驟
  • 染色劑使用戊二醛或甲醛作為增強劑，這會導致蛋白質在凝膠基質中交聯
鋅染 0.25 - 0.5 ng 15 minutes
  • 比色法
  • 質譜
  • 蛋白質印跡
  • 程序染色聚丙烯酰胺凝膠而不是蛋白質
  • 無需固定步驟 染料可以輕松去除
熒光染料 0.25 - 0.5 ng 60 minutes
  • 紫外/藍/綠光透照儀
  • 凝膠系統
  • 激光拍照
  • 質譜
  • 蛋白質印跡
  • 寬線性動態范圍和靈敏
  • 與脫色和蛋白質回收方法兼容
  • 常用于一維和二維應用

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