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熒光鬼筆環肽:可視化肌動蛋白絲的實用染色

肌動蛋白是形成微絲高度保守的蛋白質家族。在從酵母到高等真核生物(如人)之間,其氨基酸序列變化小于20%。由于其在真核細胞中的細胞內豐度很高,在微摩爾濃度之內,因此肌動蛋白對蛋白與蛋白的相互作用的參與率最高。它具有從單體狀態動態聚合成絲狀肌動蛋白(F-actin)的獨特能力。F-肌動蛋白與調節蛋白(例如肌動蛋白結合蛋白)之間的相互作用會迅速組裝和拆卸肌動蛋白絲,將它們組織成肌動蛋白束和細胞骨架網絡。這些高階結構為許多細胞過程提供了必要的機械和結構支持,包括細胞內轉運,胞質分裂,細胞運動,極性和細胞形狀,基因調控和信號轉導。由于肌動蛋白在許多生物學過程中必不可少,因此研究這些肌動蛋白結構的工具(肌動蛋白特異性抗體和鬼筆環肽衍生的染色劑)必不可少。


肌動蛋白特異性抗體:最早的F-肌動蛋白染色劑

最早的肌動蛋白染色技術通過采用熒光團標記的抗體對肌動蛋白微絲進行染色,采用了免疫組織化學(IHC)方法(Lazarides和Weber,1974)。雖然此方法在功能上可用于肌動蛋白可視化,但仍有缺點存在。

缺點1,免疫染色需要很大的工作量。它需要仔細考慮參數,包括抗體選擇,固定,抗原回收和阻斷等。如果所需的抗體不是市售的,則需要額外的時間和成本來開發和純化合適的抗體。

缺點2,抗體的利用可能是一個阻礙。通??臻g尺寸較大(約150 kDa)的抗體不能滲透細胞膜,需要在肌動蛋白染色之前對細胞進行固定和透化。正確的固定至關重要,并且取決于表位敏感性和所使用的抗體。固定保留了細胞結構,但可以降低某些細胞區室的抗原性。因此,必須優化固定條件,因為固定不足或過度固定會大大降低或阻止組織免疫反應。

缺點3,抗體偶聯物與單體和聚合肌動蛋白非特異性結合會產生高背景,從而導致低分辨率的染色。為了打破這種局限性,我們開發了對F-肌動蛋白具有增強特異性的新型肌動蛋白結合成分,作為合適的替代品。其中最引人注目的是鬼筆環肽。


鬼筆環肽

鬼筆環肽的化學結構* CAS#:17466-45-4 *(貨號5301)。

鬼筆環肽是鬼筆毒素家族的主要代表,是一種雙環七肽,從有毒的死亡帽蘑菇傘形毒蕈中分離出來。它對F-肌動蛋白亞基之間的凹槽比單體G-肌動蛋白更具有親和力。一旦與F-肌動蛋白結合,鬼筆環肽就會使單體和長絲的平衡向長絲位置移動,并抑制ATP水解。相互作用通過防止亞基解離來穩定肌動蛋白絲,并通過降低臨界濃度促進肌動蛋白聚合。結果,這些特性使得鬼筆環肽衍生物成為可視化F-肌動蛋白和細胞骨架網絡的經典染色劑。

 

鬼筆環肽衍生物的性質

自從1970年代末首次使用它對肌動蛋白進行染色以來,鬼筆環肽及其熒光衍生物一直是可視化細胞肌動蛋白絲的金標準。與IHC染色相比,鬼筆環肽衍生物在標記肌動蛋白方面具有明顯優勢。它們為鑒定,標記和定量固定和透化的細胞和組織切片中的F-肌動蛋白形成提供了一種方便的方法。

鬼筆環肽衍生物是水溶性的,當以納摩爾濃度使用時,可以選擇性地染色F-肌動蛋白。與某些抗肌動蛋白的抗體不同,鬼筆環肽與肌動蛋白絲更緊密地結合在單體上的能力會降低非特異性染色和背景噪音,從而在染色區域和未染色區域之間產生高對比度。與抗體相比,鬼筆環肽衍生物?。?lt;2 kDa),與鬼筆環肽結合的細絲不妨礙細絲的功能特性。小尺寸還允許進行更密集的F-肌動蛋白標記,以更高的分辨率成像時會產生更詳細的污點。此外,由于肌動蛋白在進化上是保守的,因此鬼筆環肽衍生物的結合特性可用于對各種動植物細胞進行染色。

 

正確選擇鬼筆環肽衍生物是試驗成功的第一步

1.未標記的鬼筆環肽: 未標記的鬼筆環肽用途有限。除了用作肌動蛋白聚合的促進劑外,未標記的鬼筆環肽通常用作阻斷F-肌動蛋白染色的對照。

2.生物素化鬼筆環肽: 生物素化的鬼筆環肽提供了一種可視化和定量肌動蛋白絲的間接方法。它需要使用熒光或酶結合的抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素進行可視化操作。雖然間接檢測具有信號放大的優勢,但對其他試劑的需求卻增加了成本和測定時間。另外,當用生物素化的鬼筆環肽染色時,需要更高濃度的鬼筆環肽綴合物,大約是熒光鬼筆環肽的兩倍。雖然有缺點,但生物素化的鬼筆環肽都適合用于pull-down實驗和免疫沉淀分析,用以研究蛋白質相互作用以及F-肌動蛋白的共定位等。

圖示:A)用F-肌動蛋白染色的鬼筆環肽iFluor 488(貨號23115)標記CPA細胞,并與溶酶體染料LysoBrite Red(貨號22645)和細胞核染料Nuclear Blue DCS1(貨號17548)共同染色;B)用F-肌動蛋白染料鬼筆環肽-iFluor 350(貨號23110)標記HeLa細胞,并與細胞核染料Nuclear Red DCS1(貨號17552)共同染色;C)用F-肌動蛋白染料鬼筆環肽-iFluor 555(貨號23119)標記HeLa細胞。與線粒體染色劑MitoLite Green(貨號22695)和細胞核染料Nuclear Blue DCS1(貨號17548)和質膜染色劑Cellpaint 深紅色(貨號22681 )共同染色。

3.熒光鬼筆環肽-iFluor 綴合物: 利用我們的iFluor 染料出色的熒光特性,AAT Bioquest開發了一系列覆蓋整個色譜的鬼筆環肽綴合物,它們選擇性地與F-肌動蛋白結合。這些iFluor 鬼筆環肽衍生物以納摩爾濃度使用,可方便用于許多肌動蛋白相關的測定。此類測定包括標記、鑒定和定量用甲醛固定和透化的組織切片中的F-肌動蛋白,細胞培養或無細胞實驗。與傳統的異硫氰酸熒光素(FITC)和羅丹明綴合物相比,鬼筆環肽-iFluor 綴合物具更高的熒光強度和光穩定性。鬼筆環肽-iFluor 700、iFluor -750和iFluor -790綴合物是少數幾種可用的近紅外染料,可與常用的紅色熒光團進行光譜分離。


用鬼筆環肽-iFluor 綴合物染色F-肌動蛋白

圖示:A)用鬼筆環肽-iFluor 488染色(貨號23115)染色的HeLa細胞的熒光圖像,并使用配備FITC濾光片的熒光顯微鏡觀察。將細胞固定在4%甲醛中,并與線粒體染料MitoLite Red FX600(貨號22677)和Nuclear Blue DCS1(貨號17548)染色;B)用鬼筆環肽-iFluor 514(貨號23116)染色的HeLa細胞的熒光圖像,并使用配備有TRITC濾光片組的熒光顯微鏡觀察。固定的細胞用Nuclear Blue DCS1(貨號17548)染色;C)用鬼筆環肽-iFluor 532(貨號23117)染色的HeLa細胞的熒光圖像,并使用配有TRITC濾光片組的熒光顯微鏡觀察。固定的細胞用Nuclear Green DCS1(貨號17550)染色;D)用鬼筆環肽-iFluor 647(貨號23127)染色的HeLa細胞的熒光圖像,并使用配備Cy5濾光片組的熒光顯微鏡觀察。首先用線粒體染料MitoLite Green(貨號22675)對活細胞進行染色。在4%甲醛中固定后,細胞用鬼筆環肽-iFluor 647標記,并用Nuclear Blue DCS1(藍色,貨號17548)染色。


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貨號 產品名稱 規格 價格
5301 鬼筆環肽* CAS#:17466-45-4 * 1毫克 2340
5302 鬼筆環肽胺 100微克 2340
23100 鬼筆環肽-AMCA標記 300Tests 1740
23101 鬼筆環肽-熒光素標記 300Tests 1740
23102 鬼筆環肽-羅丹明標記 300Tests 1740
23103 鬼筆環肽-加州紅標記 300Tests 1740
23110 鬼筆環肽-iFluor 350標記 300Tests 1740
23111 鬼筆環肽-iFluor 405標記 300Tests 1740
23115 鬼筆環肽-iFluor 488標記 300Tests 1740
23116 鬼筆環肽-iFluor 514標記 300Tests 1740
23117 鬼筆環肽-iFluor 532標記 300Tests 1740
23119 鬼筆環肽-iFluor 555標記 300Tests 1740
23122 鬼筆環肽-iFluor 594標記 300Tests 1740
23125 鬼筆環肽-iFluor 633標記 300Tests 1740
23127 鬼筆環肽-iFluor 647標記 300Tests 1740
23128 鬼筆環肽-iFluor 680標記 300Tests 3540
23129 鬼筆環肽-iFluor 700標記 300Tests 3540
23130 鬼筆環肽-iFluor 750標記 300Tests 3540
23131 鬼筆環肽-iFluor 790標記 300Tests 3540
23150 鬼筆環肽-AF350標記(升級版:鬼筆環肽-iFluor 350標記) 300Tests 3540
23153 鬼筆環肽-AF488標記(升級版:鬼筆環肽-iFluor 488標記) 300Tests 3540
23158 鬼筆環肽-AF594標記(升級版:鬼筆環肽-iFluor 594標記) 300Tests 3540

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