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將組織包埋在石蠟中進行免疫組織化學(AAT)

 

      免疫組織化學(IHC)是在組織形態學背景下監測蛋白質表達和定位的常用技術。它使用抗體來檢測和分析蛋白質表達,同時保持天然組織的組成,細胞特征和結構?;瘜W固定將細胞內和細胞間的分子相互作用鎖定在適當的位置。組織樣品可以包埋在石蠟中或冷凍,然后切成薄片并固定在載玻片上進行分析。組織的收集,保存和固定可能會因樣品或感興趣的目標而有很大差異。IHC通過特異性抗體結合來鑒定生物樣品中蛋白質表達的存在和模式??贵w與其表位之間發生的精確結合可以檢測蛋白質中靶向特定區域,結構域或切割產物的高特異性氨基酸序列??贵w還可以檢測蛋白質上的特定翻譯后修飾(PTM)。

      IHC用于疾病診斷,生物學研究和藥物開發。例如,使用特定的腫瘤標記物,醫生使用IHC來診斷腫瘤是良性還是惡性,確定其階段和等級,并確定轉移的細胞類型和起源,以便找到原發腫瘤的部位。使用IHC作為主要工具或確證程序,可以診斷出多種其他非腫瘤性疾病和病癥。在研究背景下,IHC可以單獨使用,也可以與其他分析技術結合使用,以研究例如正常組織和器官的發育,病理過程,傷口愈合,細胞死亡和修復以及許多其他領域。

 

樣品制備

1.將石蠟浸潤的組織放在帶有少量液體石蠟的模具中。短暫冷卻以固定組織,將紙盒放在模具上。裝滿液體石蠟,然后冷卻。

2.在切片機上切成薄片,然后在水浴中漂浮切片。

3.將切片裝在載玻片上并干燥過夜。

 

脫蠟/再水化

注:要進行抗體染色,必須從樣品中除去石蠟,并且必須水化。過度干燥會導致不一致的染色。

1.除石蠟,將切片分別放在新鮮的二甲苯中3分鐘。

2.開始再水化過程,請將切片放在兩個100%乙醇的容器中,每次3分鐘。

3.在兩個裝有95%乙醇的容器中孵育切片,每次1分鐘。

4.將切片放在70%的乙醇中1分鐘。

5.完成再水化過程,請在dH2O中將切片洗兩次,每次5分鐘。

 

抗原提取

注意:請參閱產品數據表以獲取有關抗體特異性方案。 過熱或過熱可能導致不一致的染色。

1.檸檬酸鹽緩沖液:

在1X檸檬酸鹽溶液中加熱載玻片直至開始沸騰;然后在亞沸點溫度(95℃-98℃)下持續20分鐘。在工作臺上冷卻切片20分鐘。

2.EDTA:

將載玻片在1mM EDTA(pH 8.0)中煮沸;然后在低于沸點的溫度下加熱15分鐘。(無需冷卻。)

3.TE:

將玻片在10mM Tris / 1mM EDTA(pH 9.0)中煮沸;保持沸騰溫度18分鐘。在室溫下冷卻30分鐘。

 

染色

1.用dH2O清洗切片3次,每次5分鐘。

2.將切片在3%過氧化氫中孵育10分鐘。(注意:此步驟對于淬滅內源性過氧化物酶活性很重要,這將有助于減少高背景染色)。

3.在dH2O中清洗兩次,每次5分鐘。

4.為防止非特異性結合,請在室溫下用首選的封閉溶液封閉每個切片30分鐘。(使用相同物種的血清作為二抗的來源。)

5.除去封閉溶液,并以建議的稀釋度添加一抗,以建議的稀釋度添加到每個部分。

6.在4°C下孵育過夜。(應按照建議進行潛伏期。)

7.除去抗體溶液,并用洗滌緩沖液洗滌切片3次,每次5分鐘。

8.在室溫下用結合有HRP的二抗覆蓋切片60分鐘。

9.用清洗緩沖液清洗切片三遍,每次5分鐘。

10.用即用的Stayright Purple覆蓋部分。在室溫下孵育5-15分鐘。(孵育的具體時間根據自身實驗而定)。

11.將切片浸入dH2O,用dH2O洗滌5-10分鐘。

12.如果需要,對部分進行復染。

13.復染后,用dH2O洗滌兩次,每次5分鐘。

 

脫水

1.將切片放在70%乙醇中2分鐘。

2.將切片放在兩個95%乙醇的容器中,每次1分鐘。

3.將切片放在兩個100%乙醇容器中,每個容器1分鐘。

4.將切片放在兩次二甲苯洗滌中,每次1分鐘。

5.用蓋玻片和有機永久性水性固定劑固定,注意避免導致氣泡。

6.顯微鏡下觀察。



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