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細胞樣品制備(全)

 

        以下是制備用于細胞測定的細胞樣品的一些通用指南。包括微孔板(或微量滴定板)和流式細胞術的應用的實例。具體實驗應始終根據每個實驗細胞制備方案,并且可能需要針對單個細胞系進行優化。

 

哺乳動物細胞:酶標儀(96/384孔板)

        每個細胞系應根據個體進行評估,以確定最佳細胞密度??梢允褂镁?D賴氨酸板促進非貼壁細胞的細胞附著。

 

貼壁細胞

        將細胞在生長培養基中過夜。表1提供了每孔細胞密度的粗略準則。通常,需要長孵育時間(2-3天)的測定應以較低的初始細胞密度進行平板接種。

 

表1:每個微孔板細胞密度指南

 

示例

96孔板

384孔板

標準孵育

鈣,NAD/NADH,膜電位

40,000至80,000個細胞/孔/100μL

10,000至20,000個細胞/孔/25μL

長期孵育

擴散,追蹤

5,000至10,000個細胞/孔/100μL

2500至5000個細胞/孔/50μL

 

非貼壁細胞

1.離心細胞并小心丟棄上清液(即培養基)。

2.將細胞沉淀重懸于細胞生長培養基或HHBS中。表2提供了重懸浮細胞密度的指南。通常,應在較低的初始細胞密度下重懸需要長孵育時間(2-3天)的測定。

3.將重懸浮的細胞轉移到測定微孔板中。

4.在實驗之前,在制動器關閉的情況下以800rpm離心微孔板2分鐘。

 

表2:每個微孔板細胞密度的指南

 

示例

96孔板

384孔板

標準孵育

鈣,NAD/NADH,膜電位

125,000至250,000個細胞/孔/100μL

30,000至60,000個細胞/孔/25μL

長期孵育

擴散,追蹤

10,000至20,000個細胞/孔/100μL

5,000至10,000個細胞/孔/50μL

 

哺乳動物細胞:流式細胞術檢測

        每個細胞系應根據個體進行評估,以確定最佳細胞密度。為了從板上分離貼壁細胞,建議使用0.5 mM EDTA??梢钥紤]酶試劑(例如胰蛋白酶,Accutase TM),但需要進行測試以確保細胞表面上的目標受體不受影響。

 

貼壁細胞

        在使用前一天在細胞生長培養基中培養細胞(400,000至800,000個細胞/ mL)

 

非貼壁細胞

1.離心細胞并小心丟棄上清液(即培養基)。

2.將細胞沉淀重懸于 500μL - 1 mL細胞生長培養基或HHBS中,濃度為500,000至1,000,000細胞/ mL。

 

其他細胞類型:制備和裂解

        以下是制備/裂解植物,細菌,哺乳動物或組織細胞樣品的一些通用指南。請注意,應根據個體評估每種細胞類型,以確定最佳細胞密度和條件。

 

植物細胞

1.用裂解緩沖液以200mg / mL均化葉子。

2.以2500rpm離心5-10分鐘。

3.使用上清液進行測試。

 

細菌細胞

1.通過離心收集細菌細胞(10,000g,0℃,15分鐘)。

2.每100至1000萬個細胞加入1mL裂解緩沖液,并在室溫下孵育處理過的溶液15分鐘。

3.以2500rpm離心5分鐘。

4.使用上清液進行測試。

 

哺乳動物細胞

1.從平板孔中取出培養基,每1至5百萬個細胞(或96孔細胞培養板中50-100μL/孔)加入約100μL裂解緩沖液。

2.將處理過的溶液在室溫下孵育15分鐘。

3.直接使用細胞裂解液或以1500 rpm離心5分鐘,然后使用上清液進行測試。

 

組織

1.稱取約20mg組織并用冷PBS洗滌。

2.在微量離心管中用400μL裂解緩沖液均化。

3.以2500rpm離心5-10分鐘。

4.使用上清液進行測定。



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