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細胞凋亡篇:細胞中的增殖凋亡探索

 

細胞凋亡是可能發生在多細胞生物中的程序性細胞死亡過程。凋亡生化事件導致特征性細胞形態變化和死亡。這些變化包括起泡、細胞收縮、核碎裂、染色質凝聚和染色體 DNA 碎裂。與壞死不同,細胞凋亡產生凋亡小體碎片,吞噬細胞能夠吞噬這些碎片當細胞內容物溢出到周圍細胞并在造成損害之前迅速將其清除。細胞增殖和凋亡的平衡對于發育和正常組織穩態都很重要。細胞增殖是由于生長和分裂而導致細胞數量增加。細胞增殖受細胞周期調節,細胞周期分為一系列階段。

自 1990 年以來,關于細胞凋亡及其相關的研究大幅增加。除了作為一種生物學現象的重要性之外,有缺陷的細胞凋亡過程還與多種疾病有關。細胞凋亡過多會導致萎縮,而數量不足會導致細胞增殖失控,例如癌癥。 百螢生物提供全面的試劑組合,用于研究各種樣品中的細胞周期、細胞增殖和細胞凋亡。


 一、細胞周期

細胞周期有四個連續的階段:G0/G1、S、G2 和 M。在細胞通過細胞周期的過程中,它的 DNA 在 S(合成)階段被復制,并在 M((有絲分裂)的兩個子細胞之間平均分布) 階段。這兩個階段由兩個間隙階段分隔:G0/G1 和 G2。這兩個間隙階段為細胞生長提供了時間,并使它們的蛋白質和細胞器的質量倍增。細胞通過細胞周期的過程由許多不同的調節蛋白控制。

我們的Cell Meter 檢測試劑盒是一套用于檢測細胞活力和增殖的工具。在正常細胞中,DNA 密度的變化取決于細胞是在生長、分裂、靜止還是進行正常細胞活動。細胞周期的進程受各種細胞周期調節因子之間復雜的相互作用的控制。這些調節因子激活轉錄因子,轉錄因子與 DNA 結合后會開啟或關閉導致細胞分裂的蛋白質的產生。這種調節過程中的任何失誤都會導致異常細胞增殖,這是許多病理狀況(例如腫瘤形成)的基礎?;罴毎芯康臐撛趹檬谴_定細胞 DNA 含量和細胞周期分布,以檢測生長模式的變化、檢測細胞凋亡以及評估腫瘤細胞行為和抑制基因機制。

 

圖1.生長的 Jurkat 細胞中的 DNA 圖譜。使用#22845進行檢測。

圖2.使用 Cell Meter 熒光細胞周期檢測試劑盒(貨號#22841)對Jurkat 細胞進行檢測。

 

表1:Cell Meter 熒光法細胞周期檢測試劑盒

品牌 名稱 貨號 規格 Ex/Em(nm)
AAT Bioquest Cell Meter 熒光法細胞周期檢測試劑盒 綠色熒光 適合于流式細胞檢測  #22841 100 Tests 503/527
AAT Bioquest Cell Meter 熒光法細胞周期檢測試劑盒 紅色熒光 適合于流式細胞檢測  #22842 100 Tests 652/682
AAT Bioquest Cell Meter 熒光法細胞周期檢測試劑盒 405nm激發  #22845 100 Tests /
AAT Bioquest Cell Meter 熒光法活細胞周期檢測試劑盒 紅色熒光 適用于流式細胞儀  #22860 100 Tests /

 

 二、細胞增殖

1.CytoTell染料

CFSE 是首選的細胞增殖指示劑,廣泛用于活細胞分析。然而,使用 CFSE 檢測細胞增殖的過程中存在一些嚴重的問題。 1. CFSE 對細胞有劇毒,因為 CFSE 會不加選擇地與所有氨基發生反應,從而影響許多關鍵的細胞內蛋白質功能(如細胞膜 GPCR); 2.CFSE響應慢,使用不方便。第二代細胞的CFSE熒光強度比第一代降低了10倍以上。 3.需要去除介質。由于 CFSE 會與培養基成分發生反應,因此您必須使用流式細胞儀去除培養基進行細胞分析。

我們研發的CytoTell染料,可以改善上述 CFSE 的缺點。 CytoTell Green 也可用于長期跟蹤標記細胞。用 CytoTell Green 標記的細胞可以固定和透化,以使用標準的含甲醛固定劑和透化緩沖液分析細胞內靶標。 CytoTell Green 可以被 488 nm 激發光線激發,峰值發射在 520 nm,這使其與 FITC 濾光片組兼容。

圖 3.CytoTell染料工作原理。 CytoTell染料由三個成分組成:a熒光阻斷劑; b掩蔽熒光團;c細胞保留部分。進入活細胞后,CytoTell 染料的熒光通過去除熒光阻斷劑釋放,釋放的熒光團通過細胞保留基團保留在細胞中

 

表2:CytoTell染料

產品名稱 貨號 規格 Ex/Em(nm)
CytoTell 綠色 22240 500 Tests 492/514
CytoTell 藍色 22251 500 Tests 410/445
CytoTell 紅色650 22255 500 Tests 626/643
CytoTell 橙色 22257 500 Tests 541/560
CytoTell紫色 500 22248 500 Tests 415/499

 

2.Brdu細胞增殖檢測試劑

在細胞周期的 S 期(DNA 合成),BrdU 被整合到新合成的 DNA 中,并且可以很容易地被抗 BrdU 特異性抗體檢測到。除了 DNA 增加外,某些蛋白質的水平也會由于細胞增殖而增加。例如,Ki67 是一種在分裂細胞核中表達的抗原。然而,在細胞周期的 G0 階段,它沒有被檢測到。 Ki67 可與其他增殖標記物(如 BrdU 和 CytoTell 染料)結合使用。

圖 4.細胞增殖表現出 DNA 合成和細胞倍增之間的密切關聯。

 

表3:Brdu細胞增殖檢測試劑

產品名稱 貨號 規格 分子量
BrdU 細胞增殖檢測試劑 17030 25 mg 307.09
BrdUTP 17031 100 ul 612.98
BrUTP 17032 100 ul 628.98

 

3.刃天青細胞增殖檢測試劑

刃天青是一種無毒、水溶性和氧化還原敏感性染料,在通過許多生物過程還原為試鹵靈后,它會從藍色/無熒光狀態變為粉紅色/高熒光狀態。添加到活細胞中的刃天青通過細胞中的酶促或化學反應通過尚不為人知的機制減少。此功能廣泛用于測量細胞增殖、活力和細胞毒性??稍谂囵B期間的任何時間加入刃天青。對于細胞增殖的測量,最好在對數生長期期間添加刃天青。孵育時間可能因被測細胞系的代謝率而異??梢允褂?544 nm/590 nm 濾光片組讀取熒光??梢允褂迷O置為 570 nm 的分光光度計讀取吸光度。

 

4.CCK-8細胞凋亡檢測試劑盒

cck-8是一種基于 WST-8 的廣泛應用于細胞增殖和細胞毒性的快速高靈敏度檢測試劑盒。其主要成分為水溶性四唑鹽 WST-8 (2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽),WST-8 是一種類似于 MTT 的化合物,在電子耦合試劑存在的情況下,可以被線粒體內的一些脫氫酶還原生成橙黃色的水溶性的甲臜(formazan)。WST-8 被細胞內脫氫酶生物還原后生成的甲臜能夠直接溶解在培養基中。細胞增殖越多越快,則顏色越深;細胞毒性越大,則顏色越淺;顏色的深淺與細胞的增殖成正比,與細胞毒性成反比。使用酶標儀在450mM波長處測定OD值,間接反映活細胞數量。對于同樣的細胞,顏色的深淺和細胞數目呈線性關系。

圖 5.CCK-8 檢測細胞活性原理圖

 

表4:cck-8及其相關產品

產品名稱 貨號 規格
Cell Counting Kit-8 (CCK-8) TJ35000-TJ35004 1ml/5ml/10ml/30ml/100ml
WST-8檢測試劑 15705-15707 25mg/100mg/1g
比色法WST-8檢測試劑盒 22770/22771 1000Tests/5000Tests
比色法MTT檢測試劑盒 22768/22769 1000Tests/5000Tests

 

5.Bucculite系列細胞增殖檢測試劑盒

檢測細胞增殖的一種基本方法是在細胞生長的S期過程中,在存在胸腺嘧啶核苷的情況下檢測DNA合成。我們的Bucculite系列產品使用FdU、XdU等,該產品是BrdU和EdU的完美替代品。

圖 6.分別使用FdU和XdU檢測S期HeLa細胞圖像。

 

表5:Bucculite系列產品

產品名稱 貨號 規格
Bucculite FdU 細胞增殖熒光成像試劑盒 22305 / 22315 / 22320 200 Tests
Bucculite XdU細胞增殖熒光成像試劑盒 22321 / 22323 / 22325 / 22326 / 22327 / 22328 100 Tests/200 Tests

 

三、細胞凋亡

表6:不同凋亡探針的特點

凋亡引起的細胞變化 可使用的探針 特點及儀器應用
細胞膜改變(PS外露) Annexin V檢測試劑/試劑盒

檢測早期凋亡標志物,流式細胞術或免疫熒光應用

Caspase激活(細胞質) Caspase 活性檢測試劑/試劑盒 快速、簡單和高通量
Caspase 結合(細胞質) 熒光半胱天冬酶抑制劑/試劑盒 ELISA、流式細胞術、Western Blot
DNA 片段化(核) BrdU檢測、TUNEL檢測 貼壁細胞、流式細胞術周期分析
線粒體變化 線粒體染色 使用流式細胞術、熒光顯微鏡或熒光酶標儀進行快速、簡單的單細胞分離

 

1.Caspase家族

細胞凋亡早期階段的一個顯著特征是半胱天冬酶的激活。 半胱氨酸——天冬氨酸特異性蛋白酶 caspase (CED-3/ICE) 家族的成員,已被確定為與細胞凋亡相關的復雜生化事件的關鍵介質。 caspase 的識別位點由三到四個氨基酸標記。 半胱天冬酶蛋白酶通常作為無活性前體合成。

圖 7.半胱天冬酶敏感的肽片段掩蔽氨基染料然后被半胱天冬酶消化以產生高度熒光染料。 熒光強度增加與半胱天冬酶活性成正比。

 

表7:人半胱天冬酶功能分類

細胞死亡途徑 Caspase類型 caspase酶 所屬生物
細胞凋亡 起始因子 Caspase 2 人或鼠
細胞凋亡 起始因子 Caspase 8 人或鼠
細胞凋亡 起始因子 Caspase 9 人或鼠
細胞凋亡 起始因子 Caspase 10
細胞凋亡 效應因子 Caspase 3 人或鼠
細胞凋亡 效應因子 Caspase 6 人或鼠
細胞凋亡 效應因子 Caspase 6 人或鼠
細胞焦亡 炎癥 Caspase 1 人或鼠
細胞焦亡 炎癥 Caspase 4
細胞焦亡 炎癥 Caspase 5
細胞焦亡 炎癥 Caspase 11
細胞焦亡 炎癥 Caspase 12 部分人或鼠
細胞焦亡 炎癥 Caspase 13

 

表8:半胱天冬酶活性的肽識別序列 對于半胱天冬酶底物和抑制劑

肽識別序列 氨基酸序列 目標Caspase
IETD Ile-Glu-Thr-Asp Caspase 8, Granzyme B
DEVD Asp-Glu-Val-Asp Caspase 3, 6, 7, 8, or 10
LEHD Leu-Glu-His-Asp Caspase 9
VAD Val-Ala-Asp Caspase 1, 2, 3, 6, 8, 9 or 10

 

表9:顯色半胱天冬酶底物

底物 目標Caspase 吸收 (nm) 顏色 規格 貨號
Ac-DEVD-pNA *CAS 189950-66-1* Caspase 3 405 nm 黃色 5 mg 13405
Z-DEVD-pNA Caspase 3 405 nm 黃色 5 mg 13422
Z-IETD-pNA *CAS 219138-21-3* Caspase 8, Granzyme B 405 nm 黃色 5 mg 13413

 

表10:熒光半胱天冬酶底物

底物 目標Caspase Ex (nm) Em (nm) ε¹ Φ² 規格 貨號
Ac-DEVD-AFC *CAS 201608-14-2* Caspase 3, 7 376 482 17000 0.53 5 mg 13401
Ac-DEVD-AMC *CAS 169332-61-0* Caspase 3, 7 341 441 19000 N/D 5 mg 13402
Z-DEVD-AFC Caspase 3, 7 376 482 17000 0.53 5 mg 13420
Z-DEVD-AMC *CAS 1135416-11-3* Caspase 3, 7 341 441 19000 N/D 5 mg 13421
Z-DEVD-ProRed™ 620 Caspase 3, 7 532 619 N/D N/D 1 mg 13433
(Z-DEVD)2-R110 *CAS 223538-61-2* Caspase 3, 7 500 522 80000 N/D 1 mg 13430
Z-DEVD-ProRed™ 620 Caspase 3, 7 532 619 N/D N/D 1 mg 13433
Ac-IETD-AFC *CAS 211990-57-7* Caspase 8, Granzyme B 376 482 17000 0.53 5 mg 13410
Ac-IETD-AMC Caspase 8, Granzyme B 341 441 19000 N/D 5 mg 13411
Z-IETD-AFC *CAS 219138-02-0* Caspase 8, Granzyme B 376 482 17000 0.53 5 mg 13425
(Ac-IETD)2-R110 Caspase 8, Granzyme B 500 522 80000 N/D 1 mg 13431
Z-IETD-ProRed™ 620 Caspase 8, Granzyme B 532 619 N/D N/D 1 mg 13434
Ac-LEHD-AMC *CAS 292633-16-0* Caspase 9 341 441 19000 N/D 5 mg 13426
(Ac-LEHD)2-R110 Caspase 9 500 522 80000 N/D 1 mg 13427
Z-LEHD_ProRed™ 620 Caspase 9 532 619 N/D N/D 1 mg 13435

 

表11:可逆和不可逆半胱天冬酶抑制劑

抑制劑 目標Caspase 結合 Ex (nm) Em (nm) 規格 貨號
Ac-DEVD-CHO *CAS 169332-60-9* Caspase 3, 7 可逆的 - - 1 mg 13403
Ac-IETD-CHO *CAS 191338-86-0* Caspase 8 可逆的 - - 5 mg 13412
mFluor 450-VAD-FMK Caspase 1, 2, 3, 6, 8, 9, 10 不可逆 406 445 25 tests 13475
mFluor™ 510-VAD-FMK Caspase 1, 2, 3, 6, 8, 9, 10 不可逆 412 505 25 tests 13476
FITC-C6-DEVD-FMK Caspase 3, 7 不可逆 491 516 1 mg 13406
FITC-C6-DEVD-FMK Caspase 3, 7 不可逆 491 516 100 µg 13408
FITC-C6-LEHD-FMK Caspase 9 不可逆 491 516 1 mg 13407
FITC-C6-LEHD-FMK Caspase 9 不可逆 491 516 100 µg 13409
FAM-VAD-FMK Caspase 1, 2, 3, 6, 8, 9, 10 不可逆 493 517 25 tests 13470
SRB-VAD-FMK [Sulforhodamine B-VAD-FMK] Caspase 1, 2, 3, 6, 8, 9, 10 不可逆 559 577 25 tests 13472
TF4-VAD-FMK Caspase 1, 2, 3, 6, 8, 9, 10 不可逆 578 602 25 tests 13471

 

1.1 Caspase 3、7、8 和 9 活性檢測

Cell Meter Caspase 活性檢測試劑盒為檢測細胞中的 Caspase 活性提供了一種強大而方便的方法。這些試劑使用含有識別位點的底物,這些識別位點專用于檢測 caspase 3 和 7、caspase 8 或 caspase 9 的激活,以及設計用于同時檢測所有四種 caspase 的多重檢測。半胱天冬酶識別序列的結合抑制了熒光團或發光團產生可量化信號的能力。在適當激活的半胱天冬酶存在的情況下,熒光團或發光團從識別序列上切割下來并自由產生表示細胞凋亡的熒光或發光信號。 

圖 8.Jurkat 細胞中 Caspase 活性的檢測。 Jurkat 細胞在同一天以 200,000 個細胞/孔接種在 Costar 黑色/透明 96 孔板中。 細胞用終濃度為 1 mM 的星形孢菌素處理 4 小時(紅色條),而未處理的細胞用作對照(藍色條)。 添加單 caspase 檢測溶液(100 µL/孔)(caspase 3/7 #1、caspase 8 #2 或 caspase 9 #3)或三重 caspase 檢測溶液(caspase #4 加入 3/7、8 和 9)并在室溫下孵育 1 小時。 使用 FlexStation 熒光酶標儀在指定波長檢測熒光強度。 caspase 3/7、8 和 9 的活性可以在單次測定中檢測到,而不受其他 caspase 的干擾。

 

表12:用于檢測 Caspase 3、7、8 和 9 活性的試劑盒

試劑盒 平臺 Ex (nm) Em (nm) 規格 貨號
Cell Meter Caspase 3/7活性細胞凋亡檢測試劑盒 藍色熒光 微孔板/HCS 360 570 200 tests 22795
Cell Meter Caspase 3/7活性細胞凋亡檢測試劑盒 綠色熒光 微孔板/HCS 490 525 200 tests 22796
Cell Meter Caspase 3/7活性細胞凋亡檢測試劑盒 紅色熒光 微孔板/HCS 540 620 200 tests 22797
Cell Meter Caspase 3/7活性細胞凋亡檢測試劑盒 綠色熒光 適合于流式細胞檢測 流式細胞儀 488 530 100 tests 22823
Cell Meter Caspase 8活性細胞凋亡檢測試劑盒 藍色熒光 微孔板/HCS 370 450 200 tests 22812
Cell Meter Caspase 8活性細胞凋亡檢測試劑盒 紅色熒光 微孔板/HCS 490 525 200 tests 22798
Cell Meter Caspase 8活性細胞凋亡檢測試劑盒 紅色熒光 微孔板/HCS 540 620 100 tests 22816
Cell Meter Caspase 9活性細胞凋亡檢測試劑盒 藍色熒光 微孔板/HCS 375 435 200 tests 22813
Cell Meter Caspase 3/7/8/9活性細胞凋亡復用檢測試劑盒 三色熒光 微孔板/HCS 三重熒光 三重熒光 100 tests 22820

 

表13:caspase 3/7 活性溶液的檢測

產品名稱 樣品類型 平臺 Ex (nm) Em (nm) 規格 貨號
Amplite 比色法Caspase 3/7活性檢測試劑盒 黃色熒光 Cell Extracts 光吸收酶標儀 490 / 200 tests 13507
Amplite 熒光法Caspase 3/7活性檢測試劑盒 藍色熒光 Cell Extracts 熒光酶標儀 350 450 500 tests 13502
Amplite 熒光法Caspase 3/7活性檢測試劑盒 綠色熒光 Cell Extracts 熒光酶標儀 490 525 500 tests 13503
Amplite 熒光法Caspase 3/7活性檢測試劑盒 紅色熒光 Cell Extracts 熒光酶標儀 535 620 100 tests 13504

 

1.2 活細胞 Caspase 結合分析

在細胞凋亡中,關鍵事件之一是半胱天冬酶的激活,這對于細胞凋亡的啟動很重要。 Cell Meter 活細胞 Caspase 結合試劑盒使用熒光細胞滲透性和無毒探針來檢測 Caspase 1、2、3/7、6、8、9、10 和 13 的活性。一旦與半胱天冬酶結合,熒光試劑就會保留在細胞內。結合后會阻止半胱天冬酶進一步催化,但不會阻止細胞凋亡的進行。 Caspase 結合試劑盒適用于熒光顯微鏡、流式細胞儀和熒光酶標儀。

 

表14:caspase 結合檢測試劑盒

產品名稱 目標Caspase Ex (nm) Em (nm) 濾波片 通道 規格 貨號
Cell Meter 活細胞Caspase 1結合檢測試劑盒 綠色熒光 Caspase 1 490 525 FITC FL1 25 Tests 20108
Cell Meter 活細胞Caspase 2結合檢測試劑盒 綠色熒光 Caspase 2 490 525 FITC FL1 25 Tests 20111
Cell Meter 活細胞Caspase 3/7結合檢測試劑盒 綠色熒光 Caspase 3/7 490 525 FITC FL1 25 Tests 20100
Cell Meter 活細胞Caspase 3/7結合檢測試劑盒 紅色熒光 Caspase 3/7 550 595 TRITC FL1 25 Tests 20101
Cell Meter 活細胞Caspase 6結合檢測試劑盒 綠色熒光 Caspase 6 490 525 FITC FL1 25 Tests 20113
Cell Meter 活細胞Caspase 8結合檢測試劑盒 綠色熒光 Caspase 8 490 525 FITC FL1 25 Tests 20115
Cell Meter 活細胞Caspase 9結合檢測試劑盒 綠色熒光 Caspase 9 490 525 FITC FL1 25 Tests 20117
Cell Meter 活細胞Caspase 10結合檢測試劑盒 綠色熒光 Caspase 10 490 525 FITC FL1 25 Tests 20119
Cell Meter 活細胞Caspase 13結合檢測試劑盒 綠色熒光 Caspase 13 490 525 FITC FL1 25 Tests 20125
Cell Meter 通用Caspase活性熒光法檢測試劑盒 紅色熒光 適合于流式細胞檢測 Caspase-1, 3/7, 4, 5, 6, 8, 9 649 664 - APC 25 Tests 22822

 

2. Annexin V

細胞膜的改變是活細胞早期凋亡的標志。在細胞凋亡的初始階段,磷脂酰絲氨酸 (PS) 殘基從細胞膜的內葉轉移到外葉。在細胞成像和流式細胞術中,熒光標記的膜聯蛋白 V 綴合物通常用于與外化 PS 殘基結合來檢測凋亡細胞。

 

表15:膜聯蛋白 V 綴合物簡介

應用 檢測外化磷脂酰絲氨酸以識別凋亡細胞
適用儀器 熒光顯微鏡、其他活細胞成像儀器和流式細胞儀
活細胞 適用
可固定 可以,用甲醛染色后固定
多路復用 可用于多重分析

 

2.1 用于檢測細胞凋亡的膜聯蛋白 V 綴合物

與 iFluor 染料結合的膜聯蛋白 V 提供了一種快速可靠的方法來檢測外化 PS。 Annexin V iFluor 探針的卓越亮度和光穩定性明顯優于大多數 Alexa Fluor® 和其他光譜相似的 Annexin v 綴合物。

 

表16:可用于細胞凋亡檢測的膜聯蛋白 V 綴合物

Annexin V 標簽 Ex (nm) Em (nm) 濾波片 ε Φ 規格 貨號
iFluor 350 345 450 DAPI 20000 0.95 100 tests (200 µL) 20070
iFluor 488 491 516 FITC 75000 0.9 100 tests (200 µL) 20071
iFluor 555 557 570 TRITC 100000 0.64 100 tests (200 µL) 20072
iFluor 594 588 604 Texas Red 180000 0.53 100 tests (200 µL) 20073
iFluor 633 640 654 Texas Red 250000 0.29 100 tests (200 µL) 20069
iFluor 647 656 670 Cy5 250000 0.25 100 tests (200 µL) 20074
iFluor 680 684 701 Cy5.5 220000 0.23 100 tests (200 µL) 20075
iFluor 700 690 713 Cy5.5 220000 0.23 100 tests (200 µL) 20077
iFluor 750 757 779 Cy7 275000 0.12 100 tests (200 µL) 20076
AF350 (Alexa Fluor® 350 equivalent) 343 441 DAPI 19000 N/D³ 100 tests (200 µL) 20090
AF488 (Alexa Fluor® 488 equivalent) 499 520 FITC 73000 0.92 100 tests (200 µL) 20092
AF594 (Alexa Fluor® 594 equivalent) 590 618 Texas Red 92000 0.66 100 tests (200 µL) 20096
FITC 491 516 FITC 73000 0.79 100 tests (200 µL) 20030
TRITC 544 570 TRITC 100000 0.1 100 tests (200 µL) 20031
Cy3 555 569 Cy3/TRITC 150000 0.04 100 tests (200 µL) 20065
Cy5 656 670 Cy5 250000 0.25 100 tests (200 µL) 20066
Cy5.5 684 701 Cy5.5 220000 0.23 100 tests (200 µL) 20067
Cy7 756 779 Cy7 250000 0.3 100 tests (200 µL) 20068

 

2.2 用于流式細胞術的膜聯蛋白 V 綴合物

與 mFluor 染料、PacBlue、APC 和 PE 結合的膜聯蛋白 V 是通過流式細胞術檢測細胞凋亡的優秀探針。這些綴合物可以與其他染料(如核酸染料)結合使用,以準確評估凋亡、壞死和死細胞的混合群體。

圖 9. 在 Jurkat 細胞中檢測 Annexin V-mFluor Violet 450 綴合物與磷脂酰絲氨酸的結合活性。

 

表16:可用于細胞凋亡檢測的膜聯蛋白 V 綴合物

Annexin V 標簽 激光 Ex (nm) Em (nm) 通道 ε Φ 規格 貨號
PacBlue Violet Laser 410 455 DAPI/FL-1 Channel 46000 0.78 100 tests (200 µL) 20089
mFluor Violet 450 Violet Laser 403 454 DAPI/FL-1 Channel 25000 0.92 100 tests (200 µL) 20080
mFluor Violet 510 Violet Laser 414 510 FITC/FL-1 Channel 30000 0.86 100 tests (200 µL) 20081
mFluor Violet 540 Violet Laser 424 560 PE/FL-2 Channel 15000 0.64 100 tests (200 µL) 20082
mFluor Blue 570 Blue Laser 533 570 PE/FL-2 Channel 120000 0.08 100 tests (200 µL) 20085

 

2.3 Cell Meter Annexin V系列凋亡檢測

Cell Meter Annexin V 凋亡檢測試劑盒提供了一種快速方便的方法,通過檢測磷脂酰絲氨酸的外化來檢測凋亡細胞。每個試劑盒都包含與 iFluor 染料、mFluor 染料、APC、PE 或 FITC 結合的重組膜聯蛋白 V,用于檢測早期凋亡細胞中易位的 PS。PI 和Nuclear Red DCS1 都不能滲透活細胞,但會用強烈的紅色熒光染色壞死和死細胞。用膜聯蛋白 V 綴合物和核酸染料染色細胞后,凋亡細胞會顯示出膜聯蛋白 V 綴合物熒光,死細胞顯示出紅色和膜聯蛋白 V 綴合物熒光,活細胞顯示出很少熒光或沒有熒光。使用流式細胞儀可以很容易地區分細胞群。

 

表17:Cell Meter Annexin V 結合凋亡檢測選擇指南

Annexin V綴合物 死細胞染色 Annexin V 綴合物 Ex/Em 死細胞染色 Ex/Em 規格 貨號
Annexin V-iFluor 488 PI 490/ 520 nm 534/617 nm 100 Tests 22824
Annexin V-iFluor 555 554/578 nm / 100 Tests 22825
Annexin V-iFluor 594 590/610 nm / 100 Tests 22826
Annexin V-iFluor 647 650/668 nm / 100 Tests 22827
Annexin V-mFluor Violet 450 PI 405/450 nm 534/617 nm 100 Tests 22828
Annexin V-mFluor™ Violet 500 PI 414/508 nm 534/617 nm 100 Tests 22829
Annexin V-mFluor Violet 550 PI 424/560 nm 534/617 nm 100 Tests 22830
Annexin V-APC PI 651/662 nm 534/617 nm 100 Tests 22837
Annexin V-PE Nuclear Red DCS1 565/575 nm 631/651 nm 100 Tests 22838
Annexin V-FITC PI 490/520 nm 534/617 nm 100 Tests 22839

 

3. TUNEL檢測

在細胞凋亡的后期階段,半胱天冬酶激活的核酸內切酶將基因組 DNA 切割成寡核小體片段(約 180-200 個堿基對長)。使用 TUNEL 檢測,這些斷裂的暴露 3'-OH 末端可以用修飾的 dUTP 進行標記,以便隨后對原位凋亡細胞進行可視化和量化。這通常是直接使用染料修飾的 dUTP 或間接使用BrdUTP和針對 BrdUTP 的抗體綴合物來完成的。無論使用怎樣的標記方式,都需要酶末端脫氧核苷酸轉移酶 (TdT) 來催化修飾的 dUTP 摻入 3'-OH 末端。

圖 10. TUNEL工作原理

 

3.1 活細胞TUNEL檢測

傳統上,TUNEL檢測需要樣品的固定和透化,以促進外源性 TdT 的進入并確保成功標記 DNA 。我們的Cell Meter 活細胞 TUNEL 細胞凋亡檢測是鑒定 DNA 片段化,無需酶 TdT 及其使用時的額外處理。這些檢測利用專有的透膜熒光染料被動進入活細胞并選擇性靶向細胞凋亡過程中形成的 DNA 切口。然后可以通過熒光顯微鏡、流式細胞術或基于熒光的微孔板檢測直接觀察熒光標記的 DNA 片段。 

Control
對照
SS 100 nM
SS 100 nM
SS 1 µM
SS 1 µM

圖 11. 與未處理的對照相比,用 100 nM 或 1 µM 星形孢菌素 (SS) 處理 4 小時后 HeLa 細胞中 TUNEL 反應的熒光圖像。

 

表18:用于活細胞的TUNEL 檢測試劑盒

試劑盒 Ex/Em (nm) Cutoff (nm) 濾波片 通道 規格 貨號
Cell Meter TUNEL凋亡檢測試劑盒 綠色熒光 490/525 515 FITC Filter Set FITC Channel 25 tests 22849
Cell Meter TUNEL凋亡檢測試劑盒 紅色熒光 550/590-650 570 TRITC Filter Set PE-Cy5 Channel 25 tests 22844

 

3.2 用于固定細胞和組織樣品的 TUNEL 檢測

Cell Meter 固定細胞和組織 TUNEL 檢測遵循傳統的 TUNEL 方法,并針對固定細胞和組織切片中的原位凋亡檢測進行了優化。這些檢測通過使用 TdT 催化染料修飾的 dUTP 并摻入片段化 DNA 的 3'-OH 末端中,直接識別群體內的凋亡細胞。然后可以分別使用熒光顯微鏡或流式細胞術對熒光標記的 DNA 片段進行可視化或定量。 

Control
No DNase
SS 100 nM
DNase

圖 12. 使用 Cell Meter 固定細胞和組織 TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒*綠色熒光*對福爾馬林固定石蠟包埋 (FFPE) 人肺腺癌切片進行 TUNEL 檢測。

 

表19:用于固定細胞和組織的 Cell Meter TUNEL 檢測試劑盒

試劑盒 dUTP Ex/Em (nm) 通道 濾波片 規格 貨號
Cell Meter 固定細胞和組織TUNEL細胞凋亡測定試劑盒*藍色熒光* DEAC-dUTP 405/525 Pacific Orange Channel Violet Filter Set 25 tests 22857
Cell Meter 固定化細胞和組織TUNEL細胞凋亡測定試劑盒*綠色熒光* Fluorescein-12-dUTP 488/530 FITC Channel FITC Filter Set 25 tests 22851
Cell Meter 固定細胞和組織TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒*紅色熒光* TMR-dUTP 488/575 PE Channel Cy3/TRITC Filter Set 25 tests 22853
Cell Meter 固定細胞和組織TUNEL細胞凋亡測定試劑盒*深紅色熒光* TF5-dUTP 633 or 640/660 APC Channel Cy5 Filter Set 25 tests 22855

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