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trFluor Eu琥珀酰亞胺酯

貨號1433存儲條件 在零下15度以下保存, 避免光照
規格1 mg價格6432
Ex (nm)346Em (nm)617
分子量1705.66溶劑DMSO
產品詳細介紹


簡要概述

trFluor Eu琥珀酰亞胺酯是美國AAT Bioquest生產的熒光染料,在細胞、血清或其他生物流體中的許多生物化合物是天然發光的,因此使用常規的快速熒光團導致測定靈敏度的嚴重限制,這是由于待測定的生物分子的自發熒光引起的高背景。使用長壽命熒光團結合時間分辨檢測(激發和發射檢測之間的延遲)可以最大限度地減少瞬間熒光干擾。 AAT Bioquest的trFluor Tb和trFluor Eu蛋白探針可為需要高靈敏度的分析啟用時間分辨熒光測定(TRF)。與更傳統的熒光團如Alexa Fluor或花青染料相比,這些trFluor 探針具有較大的斯托克斯位移和極長的發射半衰期。與其他TRF化合物相比,我們的trFluor Eu和trFluor Tb探針具有相對高的穩定性,高發射產率和與生物分子相關的能力。此外,我們的trFluor Eu和trFluor Tb探針在與抗體等生物聚合物結合時對熒光猝滅不敏感。

琥珀酰亞胺基(NHS)酯被證明是用于胺修飾的最佳試劑,因為形成的酰胺鍵基本上與天然肽鍵相同并且穩定。這些試劑通常是穩定的并且與脂族胺顯示出良好的反應性和選擇性。當琥珀酰亞胺酯化合物用于綴合反應時,需要考慮的因素很少:1)溶劑:在大多數情況下,活性染料應溶于無水二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基亞砜(DMSO)中。 2)反應pH:胺與琥珀酰亞胺酯的標記反應強烈依賴于pH。胺反應性試劑與非質子化脂族胺基團反應,包括蛋白質的末端胺和賴氨酸的氨基基團。因此,胺?;磻ǔT趐H 7.5以上進行。通過琥珀酰亞胺酯進行的蛋白質修飾通??梢栽趐H 8.5-9.5下進行。 3)反應緩沖液:當使用胺反應試劑時,必須避免使用含有游離胺如Tris和甘氨酸和硫醇化合物的緩沖液。在進行染料結合之前,還必須除去廣泛用于蛋白質沉淀的銨鹽(例如硫酸銨和乙酸銨)(例如通過透析)。 4)反應溫度:大多數綴合在室溫下進行。然而,對于特定的標記反應,可能需要升高或降低的溫度。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商,為您提供最優質的trFluor Eu琥珀酰亞胺酯。 

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產品說明書

樣本標記步驟

注意:該標記方案是針對山羊抗小鼠IgG與trFluor Eu SE的綴合物開發的。請根據您的具體實驗進行調整。

 

1.準備蛋白質儲備溶液(溶液A):

將100L反應緩沖液(例如,1M碳酸鈉溶液或1M磷酸鹽緩沖液,pH~9.0)與900L目標蛋白質溶液(例如抗體,蛋白質濃度> 2mg / ml,如果可能)混合,得到1 mL蛋白標記儲備液。

注意1:蛋白質溶液(溶液A)的pH值應為8.5±0.5。 如果蛋白質溶液的pH低于8.0,則使用1M碳酸氫鈉溶液或1M pH 9.0磷酸鹽緩沖液將pH調節至8.0-9.0的范圍。

注意2:蛋白質應溶解于pH7.2-7.4的1X磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中。 如果蛋白質溶解在Tris或甘氨酸緩沖液中,則必須用pH7.2-7.4的1X PBS透析,以除去廣泛用于蛋白質沉淀的游離胺或銨鹽(例如硫酸銨和乙酸銨)。

注意3:用牛血清白蛋白(BSA)或明膠穩定的不純抗體或抗體不能很好地標記。 疊氮化鈉或硫柳汞的存在也可能干擾綴合反應。 可以通過透析或旋轉柱除去疊氮化鈉或硫柳汞,以獲得最佳標記結果。

注意4:如果蛋白質濃度低于2 mg / mL,則結合效率顯著降低。 為獲得最佳標記效率,建議最終蛋白質濃度范圍為2-10 mg / mL。

 

2.準備染料儲備溶液(溶液B):

將無水DMSO加入到小瓶trFluor?Eu SE中以制備10-20mM儲備溶液。 通過移液或渦旋混合均勻。

注意:在開始綴合之前準備染料儲備溶液(溶液B),需及時使用。染料儲備溶液的長期儲存可降低染料活性。溶液B可以在不受光照和潮濕的情況下儲存在冰箱中兩周。避免凍融循環。

 

3.確定最佳染料/蛋白質比例(可選):

注意:每種蛋白質都需要不同的染料/蛋白質比例,這也取決于染料的性質。 蛋白質的過度標記可能對其結合親和力產生不利影響,而低染料/蛋白質比率的蛋白質結合物會降低靈敏度。 我們建議您通過使用連續不同量的標記染料溶液重復步驟4和5來實驗確定最佳染料/蛋白質比率。 通常,對于大多數染料 - 蛋白質綴合物,推薦使用4-6種染料/蛋白質。

 

3.1使用10:1摩爾比的溶液B(染料)/溶液A(蛋白質)作為起點:將5μl染料儲備溶液(溶液B,假設染料儲備溶液為10 mM)加入到樣品瓶中。 蛋白質溶液(95μl溶液A)有效搖動。 假設蛋白質濃度為10mg / mL并且蛋白質的分子量為~200KD,蛋白質的濃度為~0.05mM。

注意:蛋白質溶液中DMSO的濃度應<10%。

3.2運行結合反應(見下面的步驟4)。

3.3重復#3.2,溶液B /溶液A的摩爾比為5:1; 分別為15:1和20:1。

3.4使用預制的旋轉柱純化所需的綴合物。

3.5計算上述4種結合物的染料/蛋白質比例(DOS)(見下文)。

3.6運行上述4種結合物的功能測試,確定最佳的染料/蛋白質比例,以擴大標記反應。

 

4.運行結合反應:

4.1在有效搖動下,將適量的染料儲備溶液(溶液B)加入到蛋白質溶液(溶液A)的小瓶中。

注意:溶液B /溶液的最佳摩爾比由步驟3.6確定。 如果跳過步驟3,我們建議使用10:1摩爾比的溶液B(染料)/溶液A(蛋白質)。

4.2繼續在室溫下旋轉或搖動反應混合物30-60分鐘。

 

5.純化綴合物

以下方案是使用Sephadex G-25柱純化染料 - 蛋白質綴合物的實例。

5.1按照制造說明準備Sephadex G-25色譜柱。

5.2將反應混合物(直接來自步驟4)加載到Sephadex G-25柱的頂部。

5.3一旦樣品在頂部樹脂表面下方運行,加入PBS(pH 7.2-7.4)。

5.4將更多PBS(pH 7.2-7.4)加入所需樣品中以完成柱純化。 合并含有所需染料 - 蛋白質綴合物的級分。

注意1:立即使用時,染料 - 蛋白質偶聯物需要用染色緩沖液稀釋,并等分多次使用。

注意2:對于長期儲存,染料 - 蛋白質綴合物溶液需要濃縮或冷凍干燥(見說明書)。

 

參考文獻

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產品名稱 貨號
trFluor Eu馬來酰亞胺 Cat#1434
trFluor Tb琥珀酰亞胺酯 Cat#1443


說明書
trFluor Eu琥珀酰亞胺酯.pdf


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