ReadiCleave iFluor 594 AML-NHS 酯

貨號7007存儲條件 在零下15度以下保存, 避免光照
規格1 mg價格4740
Ex (nm)588Em (nm)604
分子量1509.77溶劑DMSO
產品詳細介紹


簡要概述

許多生物分子可以很容易地用熒光標簽進行標記,用于熒光成像和流式細胞術分析。然而,大多數現有的熒光標簽用于永久標記生物靶標,添加的熒光標簽無法從這些靶標上切割下來用于進一步的下游分析,例如質譜分析或其他檢測。 AAT Bioquest 的 ReadiCleave 探針能夠將熒光標簽與生物靶標結合,需要時可以從生物靶標上去除添加的熒光標簽。 ReadiCleave iFluor 594 AML 包含一個疊氮甲基探針,可以用 TCEP 切割以從目標分子中去除 iFluor 594 熒光團??梢酝ㄟ^添加 10-100 mM TCEP 溶液 (pH 7.5) 并在 65°C 下孵育 1-5 分鐘來進行裂解。 iFluor 594 是 Alexa Fluor® 594 的卓越替代品。 iFluor 594 和 Alexa Fluor® 594 具有非常相似的光譜特性。

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樣品分析方案

儲備溶液配制

1. 蛋白質原液(溶液 A)
將 100 µL 反應緩沖液(例如,1 M 碳酸鈉溶液或 1 M 磷酸鹽緩沖液,pH ~ 9.0)與 900 µL 目標蛋白溶液(例如抗體,如果可能,蛋白質濃度 >2 mg/mL)混合,得到 1 mL 蛋白質標記原液。
注意蛋白質溶液(溶液 A)的 pH 值應為 8.5 ± 0.5。如果蛋白質溶液的 pH 值低于 8.0,則使用 1 M 碳酸氫鈉溶液或 1 M pH 9.0 磷酸鹽緩沖液將 pH 值調整到 8.0-9.0 的范圍內。
注意 蛋白質應溶于 1X 磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS),pH 7.2-7.4。如果蛋白質溶解在 Tris 或甘氨酸緩沖液中,則必須用 1X PBS,pH 7.2-7.4 進行透析,以去除用于蛋白質沉淀的游離胺或銨鹽(如硫酸銨和醋酸銨)。
注意 如果蛋白質濃度低于 2 mg/mL,綴合效率會明顯降低。為獲得最佳標記效率,建議最終蛋白質濃度范圍為 2-10 mg/mL。

 

2. ReadiCleave iFluor 594 AML-NHS 酯儲備溶液(溶液 B)
將無水 DMSO 添加到 ReadiCleave iFluor 594 AML-NHS 酯小瓶中,制成 10 mM 儲備溶液。 通過移液或渦旋混合均勻。
注意 在開始偶聯之前準備染料儲備溶液(溶液 B),并及時使用。 染料原液的長期儲存可能會降低染料活性。 溶液 B 在避光和防潮的情況下可以在冰箱中儲存兩周。 避免凍融循環。

 

操作步驟

該標記方案是為山羊抗小鼠 IgG 與 ReadiCleave iFluor 594 AML-NHS 酯的偶聯而開發的。您可能需要進一步優化您的特定蛋白質。 注意 每種蛋白質需要不同的染料/蛋白質比例,這也取決于染料的特性。蛋白質的過度標記會對其結合親和力產生不利影響,而低染料/蛋白質比率的蛋白質綴合物會降低靈敏度。

 

1.進行綴合反應
使用 10:1 的溶液 B(染料)/溶液 A(蛋白質)的摩爾比作為起點:將 5 μL 的染料儲備溶液(溶液 B,假設染料庫存溶液為 10 mM)在有效搖動下倒入蛋白質溶液(95 µL 溶液 A)小瓶中。 假設蛋白質濃度為 10 mg/mL 且蛋白質的分子量為 ~200KD,則蛋白質的濃度為 ~0.05 mM。
注意 我們建議使用 10:1 摩爾比的溶液 B(染料)/溶液 A(蛋白質)。 如果太低或太高,分別確定最佳染料/蛋白質比例為 5:1、15:1 和 20:1。

2.在室溫下繼續旋轉或搖動反應混合物 30-60 分鐘。

純化結合
以下方案是使用 Sephadex G-25 柱進行染料-蛋白質綴合物純化的示例。
1.根據說明準備 Sephadex G-25 柱。
2.將反應混合物(來自“進行綴合反應”)加載到 Sephadex G-25 列的頂部。
3.樣品剛好在頂部樹脂表面下方運行時,立即添加 PBS (pH 7.2-7.4)。
4.向所需樣品中添加更多 PBS (pH 7.2-7.4) 以完成柱純化。 結合含有所需染料-蛋白質綴合物的組分。
注意 要立即使用,染料-蛋白質綴合物需要用染色緩沖液稀釋,并分裝多次使用。
注意 對于長期儲存,染料-蛋白質綴合物溶液需要濃縮或冷凍干燥。

 

數據分析

1.表征所需的染料-蛋白質綴合物
取代度 (DOS) 是表征染料標記蛋白質的最重要因素。 較低 DOS 的蛋白質通常具有較弱的熒光強度,但較高 DOS 的蛋白質(例如 DOS > 6)也往往具有較低的熒光強度。 大多數抗體的最佳 DOS 建議在 2 到 10 之間,具體取決于染料和蛋白質的特性。為了有效標記,應控制取代度,使 6-8 摩爾 ReadiCleave iFluor 594 AML-NHS 酯與 1 摩爾抗體相配。 以下步驟用于確定 ReadiCleave iFluor 594 AML-NHS 酯標記蛋白質的 DOS。

2.吸收檢測
要檢測染料-蛋白質綴合物的吸收光譜,建議將樣品濃度保持在 1-10 µM 的范圍內,具體取決于染料的消光系數。

讀取 280 nm 處的 OD(吸光度)和染料最大吸光度(對于 ReadiCleave iFluor 594 AML-NHS 酯染料,?max = 541 nm)
對于大多數分光光度計,樣品(來自色譜柱餾分)需要用去離子水稀釋,以便 OD 值在 0.1 到 0.9 的范圍內。 OD(吸光度)在 280 nm 是蛋白質的最大吸收,而 541 nm 是 ReadiCleave iFluor 594 AML-NHS 酯的最大吸收。 要獲得準確的 DOS,請確保綴合物中不含非結合染料。

3.計算DOS

您可以通過點擊鏈接使用我們的工具計算DOS計算

 

參考文獻

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