Peko Green雙鏈核酸染料

Peko Green 染料是一種新型的dDNA染料。其檢測靈敏度高，可檢測到pg級DNA。檢測范圍寬，可跨越4個數量級。特異性好，基本不受ssDNA和RNA的影響，并且可以耐受一定濃度的鹽，尿素，已醇，氯仿，去垢劑，蛋白等干擾。對微量的雙鏈DNA進行定量在各種生物學應用中都顯得非常重要。例如cDNA文庫的構建，亞克隆的DNA片段的純化，定量DNA擴增產物，在藥物中DNA分子殘留的測定等。檢測核酸濃度最常用的方法就是檢測核酸在260nm (A260)處的光吸收，此方法主要的缺點是單鏈核酸和單核苷酸會產生干擾信號，核酸樣品中的雜質也會影向結果。光吸收不能區分DNA和RNA，靈敏度也相對較低（用1cm的比色杯在A260值為0.1時相對應的雙鏈DNA濃度為5μg/mL）。目前使用Peko Green 染料定量檢測DNA已經廣泛用于生物學檢測。

實驗方法

1.試劑準備

Peko Green是以1毫升的濃縮液形式保存在無水DMSO（二甲基亞砜）中。實驗當天，配制2x Peko Green試劑的工作溶液,用1xTE液（10mM的Tris-HCl，1mM EDTA中，pH值為7.5）按1:200的比例稀釋濃縮液。如果要準備好足夠的工作液檢測20個樣品，可在20毫升1xTE加入100μL Peko Green dsDNA定量試劑。由于試劑容易吸附到玻璃表面，要在一個塑料容器中配制。Peko Green試劑容易光降解，所以應將配好的溶液用箔包主或放置暗處避光保存。溶液最好在配制數小時內使用，以保證最佳結果。

2.DNA標準曲線

2.1 標準品工作液的配制：

Sigma小牛胸腺DNA干粉（貨號：D4522-1MG）1mg (Tris, NaCL等濃度已成標準體系)，加入1mL雙蒸水，配制成1mg/mL的標準工作液。

2.2 標準品工作液的稀釋：

母液稀釋：取10mL(1mg/mL) 標準品工作液加入到990 μLTE溶液中，稀釋成10μg/mL。再取10μL（10mg/mL）標準品工作液加入到990 μLTE溶液中，稀釋成100ng/mL。

倍比稀釋：取800μL(100ng/mL) 標準品工作液加入到200 μLTE溶液中，稀釋成80ng/mL（藥典規定：熒光染色方法DNA含量在。25-80ng/mL范圍線性較好，此方法DNA檢出限為0.3ng/mL）。再取500mL（80ng/mL）標準品工作液加入到500 mLTE溶液中，濃度稀釋到40ng/mL。然后按倍比稀釋成20ng/mL，10ng/mL，5ng/mL，2.5ng/mL，1.25ng/mL，0.625ng/mL的標準品溶液，見表1。

表 1標準品工作液及樣品排續在一個實心的黑色96孔板*

*備注: DS= 標準品工作液從0到40ng/mL平行樣品

3.雙鏈DNA樣品分析

3.1倍比稀釋后的各梯度標準品溶液，樣品，和染料工作液各取100μL混勻，避光室溫放置5分鐘見表1。

備注: 如果用 384孔板, 則倍比稀釋后的各梯度標準品溶液，樣品，和染料工作液各取25mL即可。

3.2用熒光酶標儀在激發/發射波長= 490/525 nm（截止波長為510 nm）檢測熒光強度。

3.3樣品DNA 含量可根據標準品曲線算出。