胱天蛋白酶Caspase抑制劑mFluor 450-VAD-FMK

胱天蛋白酶Caspase抑制劑mFluor 450-VAD-FMK是美國AAT Bioquest生產的用于Caspase的試劑，FAM- VAD具有藍色熒光細胞滲透性抑制靶向胱天蛋白酶1 ，2，3 ，6，8 ，9或10 。一旦進入細胞，所述抑制劑共價結合胱天蛋白酶，產生綠色熒光。當加入到細胞群體中， FAM- VAD -FMK探針進入每個細胞與共價結合到駐留在胱天蛋白酶活性的異二聚體的VAD-FMK，從而抑制酶活性的反應性半胱氨酸殘基。結合的標記試劑被保留在細胞內，而任何未結合的試劑將擴散出細胞，并沖走。綠色熒光信號的直接測量活性胱天蛋白酶的存在于細胞中的試劑加入的時間量。含有結合的標記試劑細胞可以通過96 - 孔板的基于熒光，熒光顯微鏡或流式細胞儀進行分析。該探頭具有光譜性質類似于Pacific Blue®和BD Horizon V450 ，Pacific Blue這樣的過濾器®和BD Horizon V450可以方便的用流式細胞儀或顯微鏡使用。該探頭是特別設計用于多色檢測半胱氨酸蛋白酶與紫激光裝備 。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商，為您提供最優質的胱天蛋白酶Caspase抑制劑mFluor 450-VAD-FMK。 

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樣品操作及分析

以下協議僅提供指導，應根據您的特定需求進行修改。

使用AMC，AFC，pNA，R110和ProRed底物的常規解決方案胱天蛋白酶測定

1.在DMSO中準備10 mM的儲備溶液。

2.如下準備2X半胱天冬酶底物（50 µM）分析溶液：50 µL底物原液，100 µL DTT（1M），400 µL EDTA（100 mM），10 mL Tris Buffer（20 mM），pH = 7.4。

3.將等體積的半胱天冬酶標準品或樣品與2X半胱天冬酶底物測定溶液混合，并在室溫下孵育至少1小時。

4.使用熒光酶標儀監測熒光，或使用酶標儀監測吸光度。

使用細胞滲透性FMK Caspase探針的細胞Caspase測定

1.在DMSO中準備2-5 mM的儲備溶液。

2.根據需要處理細胞。

3.通過用20 mM Hepes緩沖液（HHBS）在Hanks中稀釋DMSO儲備溶液（來自步驟2.1），制備2X滲透性半胱天冬酶底物（20 µM）分析溶液。

4.將等體積的處理過的細胞與2X半胱天冬酶底物測定溶液混合（來自步驟2.3），并在37°C，5％CO2的培養箱中孵育細胞至少1小時。

5.用HHBS清洗細胞至少一次。

6.通過流式細胞儀，熒光顯微鏡或熒光酶標儀監測熒光強度。

使用細胞滲透性FMK Caspase探針進行細胞半胱天冬酶測定（僅適用于＃13470-13476）

1.通過向小瓶中加入50 µL DMSO制備250X儲備液。

2.根據需要處理細胞。

3.以1：250的比例將250 X DMSO儲備溶液添加到細胞溶液中（例如2 µL至500 µL細胞），并將細胞在37°C，5％CO2的培養箱中孵育1小時。

4.用HHBS清洗細胞至少一次。

5.通過流式細胞儀，熒光顯微鏡或熒光酶標儀監測熒光強度。

參考文獻

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