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mFluor Blue 580琥珀酰亞胺酯

貨號1178存儲條件 在零下15度以下保存, 避免光照
規格1 mg價格3648
Ex (nm)485Em (nm)580
分子量832.98溶劑DMSO
產品詳細介紹


簡要概述

光譜流式細胞儀的進步已經超越了常規流式細胞儀的應用范圍和功能?,F在,借助光譜流式細胞儀分析,研究人員和科學家們可以研究越來越多的目標分子。然而,熒光標記和讀數的可用性嚴重限制了光譜流式細胞術的潛力。AAT Bioquest的mFluor™染料專為針對多色流式細胞儀的應用而開發,尤其是用于光譜熒光流式細胞儀。mFluor™Blue 580染料可以用488 nm的藍色激光充分激發。它具有巨大的斯托克斯位移,發射波長約為580 nm。mFluor™Blue 580染料是水溶性的,用mFluor™Blue 580染料制備的蛋白質偶聯物在488 nm處被激發,產生紅色熒光。mFluor™Blue 580染料和結合物是用于流式細胞儀檢測的出色的藍色熒光試劑。與RPE相比,mFluor™Blue 580染料具有更高的光穩定性,使其易于用于熒光成像應用,而由于RPE共軛物的快速光漂白,很難將RPE共軛物用于熒光成像應用。它也是用于光譜流式細胞儀的獨特熒光染料,因為很少有具有這種光譜特征的現有染料。



產品說明書

樣品分析方案 

儲備溶液配制

1.蛋白質儲備液(溶液A)
將100 µL反應緩沖液(例如1 M碳酸鈉溶液或pH值為9.0的1 M磷酸鹽緩沖液)與900 µL目標蛋白溶液(例如抗體,如果可能,蛋白濃度> 2 mg / mL)混合,得到1 mL蛋白質標記儲備液。
注意:蛋白質溶液(溶液A)的pH值應為8.5±0.5。如果蛋白質溶液的pH值低于8.0,請使用1 M碳酸氫鈉溶液或1 M pH 9.0磷酸鹽緩沖液將pH值調整為8.0-9.0。
注意:蛋白質應溶于pH 7.2-7.4的1X磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中。如果將蛋白質溶解在Tris或甘氨酸緩沖液中,則必須使用pH 7.2-7.4的1X PBS進行透析,以去除廣泛用于蛋白質沉淀的游離胺或銨鹽(例如硫酸銨和乙酸銨)。
注意:如果蛋白質濃度低于2 mg / mL,結合效率會大大降低。為了獲得最佳標記效率,建議最終蛋白質濃度范圍為2-10 mg / mL。

2.染料原液(溶液B)
在mFluor™藍色580 SE小瓶中加入無水DMSO,制成10-20 mM的儲備溶液。通過輕柔移液或渦旋混合均勻。
注意:開始綴合之前,請準備染料儲備溶液(溶液B)。立即使用。染料儲備溶液的長時間儲存??可能會降低染料活性。避免凍融循環。
注意:收到后,mFluor™藍色580 SE應儲存在<-15°C的環境中,并遠離光線和濕氣。
注意:重新配制的mFluor™染料SE的DMSO儲備溶液可以在<-15°C下保存長達4周。
注意:所需的蛋白質偶聯物應在載體蛋白質(例如0.1%牛血清白蛋白)存在的情況下以> 0.5 mg / mL的濃度保存。當在2 mM疊氮化鈉存在下存儲時,結合物溶液可以在4°C下存儲兩個月而無明顯變化。為了更長的存儲時間,可以將蛋白結合物凍干或分成單份使用,并保存在≤-60°C下,并避光。

 

操作步驟

該標記方案是針對山羊抗小鼠IgG與mFluor™藍色580 SE的綴合物而開發的。您可能需要進一步優化您的特定蛋白質。
確定最佳的染料/蛋白質比率(可選)
每種蛋白質都需要不同的染料/蛋白質比率,這也取決于染料的性質。蛋白質的過度標記可能會不利地影響其結合親和力,而低染料/蛋白質比率的蛋白質綴合物會降低靈敏度。我們建議您使用一系列不同量的標記染料溶液,通過實驗確定最佳的染料/蛋白質比率。通常,大多數染料-蛋白質結合物推薦使用4-6種染料/蛋白質。
  1. 以溶液B(染料)/溶液A(蛋白質)的10:1摩爾比為起點:將5 µL染料儲備溶液(溶液B,假定染料儲備溶液為10 mM)添加到蛋白質瓶中。溶液(95 µL溶液A)有效搖動。假設蛋白質濃度為10 mg / mL,蛋白質的分子量為?200KD,則蛋白質的濃度約為0.05 mM。
    注意:蛋白質溶液中DMSO的濃度應小于10%。
  2. 進行綴合反應。
  3. 重復步驟2,溶液B /溶液A的摩爾比為5:1;15:1和20:1。
  4. 使用預制的旋轉柱純化所需的結合物。
  5. 計算上述4種結合物的染料/蛋白質比率(DOS)。
  6. 對以上4種結合物進行功能測試,以確定最佳的染料/蛋白質比率,以擴大標記反應的范圍。 


運行綴合反應
  1. 在有效搖動下,將適量的染料儲備溶液(溶液B)添加到蛋白質溶液(溶液A)的小瓶中。
    注意:溶液B /溶液的最佳摩爾比由上述步驟確定。如果跳過該步驟(本節:確定最佳的染料/蛋白質比),我們建議使用溶液B(染料)/溶液A(蛋白質)的摩爾比為10:1。
  2. 在室溫下繼續旋轉或搖動反應混合物30-60分鐘。 


純化
以下方案是使用Sephadex G-25色譜柱純化染料-蛋白質偶聯物的示例。
  1. 準備Sephadex G-25色譜柱。
  2. 將反應混合物(進行共軛反應后的混合物)加載到Sephadex G-25色譜柱的頂部。
  3. 樣品剛好在頂部樹脂表面下方流動時,立即添加PBS(pH 7.2-7.4)。
  4. 向所需樣品中添加更多PBS(pH 7.2-7.4),以完成柱純化。
    注意:為了立即使用,染料-蛋白質偶聯物需要用染色緩沖液稀釋,并分裝多次使用。
    注意:為了長期保存,染料-蛋白質結合物溶液需要濃縮或冷凍干燥。 

 

參考文獻

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說明書
mFluor Blue 580琥珀酰亞胺酯.pdf


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