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Amplite NAD+/NADH檢測試劑盒(熒光法) 紅色熒光

貨號15257存儲條件 在零下15度以下保存, 避免光照
規格400 Tests價格3840
Ex (nm)571Em (nm)585
分子量溶劑
產品詳細介紹


簡要概述

Amplite NAD+/NADH檢測試劑盒(熒光法) 紅色熒光是AAT Bioquest研發的檢測NAD+/NADH的試劑盒。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD +)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP +)是細胞中發現的兩種重要的輔因子。NADH是NAD +的還原形式,NAD +是NADH的氧化形式。NAD形成NADP,通過酯鍵將磷酸基團添加到腺苷核苷酸的2'位置。NADP用于合成代謝生物反應,例如脂肪酸和核酸合成,其需要NADPH作為還原劑。 在葉綠體中,NADP是在光合作用的初步反應中重要的氧化劑。通過光合作用產生的NADPH用作卡爾文光合作用循環中生物合成反應的還原能力。

傳統的NAD / NADH和NADP / NADPH測定通過監測340nm處NADH或NADPH吸收的變化來進行。 Amplite™熒光總NAD和NADH檢測試劑盒為敏感檢測NAD和NADH提供了一種便捷的方法。系統中的酶特異性識別酶循環反應中的NAD / NADH,其顯著提高了檢測靈敏度。此外,該測定具有非常低的背景,因為其在紅色可見范圍內運行,這顯著降低了生物樣品引起的干擾。該測定已證明在Ex / Em = 540 / 590nm處具有高靈敏度和低干擾。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商,為您提供最優質的Amplite NAD+/NADH檢測試劑盒。

Amplite™熒光總NAD和NADH分析試劑盒提供靈敏的一步法分析,可在100μL分析體積(100nM;圖1)中檢測少至10皮摩爾的NAD(H)。 該測定可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式進行,并且容易適應自動化而無需分離步驟。 其信號可通過熒光酶標儀在Ex / Em = 530-570nm / 590-600nm(最大Ex / Em = 540 / 590nm)或吸光度酶標儀在~576nm處容易地讀取。



產品說明書

96孔板測定示例

 

概述

準備NAD / NADH反應混合物(50μL)

添加NADH標準品或測試樣品(50μL)

在室溫下孵育15分鐘--2小時

監測Ex / Em = 540 / 590nm處的熒光強度

 

操作方法

1.準備NADH儲備溶液:

將200μLPBS緩沖液加入到NADH標準品(組分C)的小瓶中,得到1mM(1nmol / L)NADH儲備溶液。

注意:未使用的NADH儲備溶液應分成單次使用的等分試樣并儲存在-20℃。

2.準備NAD / NADH反應混合物:

將10mL NAD / NADH傳感器緩沖液(組分B)加入NAD / NADH再循環酶混合物(組分A)的瓶中,并充分混合。

注意:NAD / NADH反應混合物足以用于兩個96孔板。 未使用的NAD / NADH反應混合物應分成一次性等分試樣并儲存在-20℃。

3.準備NADH標準品的系列稀釋液(0至10μM):

3.1將10μL的NADH儲備溶液(來自步驟1)加入到990L PBS緩沖液(pH 7.4)中,以產生10μM(10pmol / L)NADH標準溶液。

注意:稀釋的NADH標準溶液不穩定,應在4小時內使用。

3.2取200μL10μMNADH標準溶液進行1:3連續稀釋,得到NADH標準品的3,1,0.3,0.1,0.03,0.01和0μM連續稀釋液。

3.3如表1和2中所述,將含有NADH標準品和含NAD / NADH的測試樣品的系列稀釋液加入到固體黑色96孔微量培養板中。

注意:根據需要準備細胞或組織樣本。

 

表1實心黑色96孔微孔板中NADH標準品和測試樣品的布局

BL

BL

TS

TS

NS1

NS1

….

….

NS2

NS2

 

 

NS3

NS3

 

 

NS4

NS4

 

 

NS5

NS5

 

 

NS6

NS6

 

 

NS7

NS7

 

 

注意:NS = NADH標準,BL =空白對照,TS =測試樣品。

 

表2.每個孔的試劑組成

NADH Standard

Blank Control

Test Sample

Serial Dilutions*: 50 μL

PBS: 50 μL

50 μL 

注意:將連續稀釋的NADH標準品(0.01μM至10μM)加入NS1至NS7的孔中,一式兩份。 高濃度的NADH(例如,>100μM,最終濃度)可能由于NADH傳感器(對非熒光產物)的過度氧化而導致熒光信號降低。

 

4.在上清液反應中運行NAD / NADH測定:

4.1將50μL的NADH反應混合物(來自步驟2)加入NADH標準品,空白對照和測試樣品(來自步驟3.3)的每個孔中,使得總NADH測定體積為100μL/孔。

注意:對于384孔板,每孔加入25μL樣品和25μLNADH反應混合物。

4.2在室溫下孵育反應15分鐘至2小時,避光。

4.3用Ex / Em = 540 / 590nm的熒光板讀數器監測熒光增加。

注1:也可將板的內容物轉移到白色透明底板上,用吸光度酶標儀在576±5nm波長下讀數。 與熒光讀數相比,吸收檢測具有較低的靈敏度。

注意2:對于NAD / NADH比率測量,建議使用試劑盒15263。

注意3:對于基于細胞的NAD / NADH測量,建議使用ReadiUse™哺乳動物細胞裂解緩沖液* 5X *(目錄號20012)裂解細胞。

 

數據分析

 

        空白孔中的熒光(僅用PBS緩沖液)用作對照,并從具有NADH反應的那些孔的值中減去。 NADH標準曲線如圖1所示。

注意:熒光背景隨時間增加,因此減去每個數據點的空白孔的熒光強度值是很重要的。

圖1.使用NOVOStar酶標儀(BMG Labtech),在固體黑色96孔板中用Amplite TM總NAD和NADH測定試劑盒測量NADH劑量反應。 在孵育1小時(n = 3)時可以檢測到低至100nM(10pmol /孔)的NADH,而NADPH沒有響應。

 

試劑應用文獻

Epigenetic regulation of Runx2 transcription and osteoblast differentiation by nicotinamide phosphoribosyltransferase

Authors: Ling, Min and Huang, Peixin and Islam, Shamima and Heruth, Daniel P and Li, Xuanan and Zhang, Li Qin and Li, Ding-You and Hu, Zhaohui and Ye, Shui Qing
Journal: Cell & Bioscience (2017): 27

 

參考文獻

Enhanced 1, 3-propanediol production in Klebsiella pneumoniae by a combined strategy of strengthening the TCA cycle and weakening the glucose effect
Authors: Xinyao Lu, Shunli Ren, Jingzheng Lu, Hong Zong, Jian Song, Bin Zhuge
Journal: Journal of applied microbiology (2018)

Celastrol attenuates angiotensin II mediated human umbilical vein endothelial cells damage through activation of Nrf2/ERK1/2/Nox2 signal pathway
Authors: Miao Li, Xin Liu, Yongpeng He, Qingyin Zheng, Min Wang, Yu Wu, Yuanpeng Zhang, Chaoyun Wang
Journal: European Journal of Pharmacology (2017): 124--133

Cytosolic Redox Status of Wine Yeast (Saccharomyces Cerevisiae) under Hyperosmotic Stress during Icewine Fermentation
Authors: Fei Yang, Caitlin Heit, Debra L Inglis
Journal: Fermentation (2017): 61

Epigenetic regulation of Runx2 transcription and osteoblast differentiation by nicotinamide phosphoribosyltransferase
Authors: Min Ling, Peixin Huang, Shamima Islam, Daniel P Heruth, Xuanan Li, Li Qin Zhang, Ding-You Li, Zhaohui Hu, Shui Qing Ye
Journal: Cell & Bioscience (2017): 27

MCU-dependent mitochondrial Ca2+ inhibits NAD+/SIRT3/SOD2 pathway to promote ROS production and metastasis of HCC cells
Authors: T Ren, H Zhang, J Wang, J Zhu, M Jin, Y Wu, X Guo, L Ji, Q Huang, H Yang
Journal: Oncogene (2017)

Metabolic and molecular insights into an essential role of nicotinamide phosphoribosyltransferase
Authors: Li Q Zhang, Leon Van Haandel, Min Xiong, Peixin Huang, Daniel P Heruth, Charlie Bi, Roger Gaedigk, Xun Jiang, Ding-You Li, Gerald Wyckoff
Journal: Cell Death & Disease (2017): e2705

Pyrroloquinoline Quinone, a Redox-active o-Quinone, Stimulates Mitochondrial Biogenesis by Activating SIRT1/PGC-1α Signaling Pathway
Authors: Kazuhiro Saihara, Ryosuke Kamikubo, Kazuto Ikemoto, Koji Uchida, Mitsugu Akagawa
Journal: Biochemistry (2017)

Resveratrol attenuates excessive ethanol exposure induced insulin resistance in rats via improving NAD+/NADH ratio
Authors: Gang Luo, Bingqing Huang, Xiang Qiu, Lin Xiao, Ning Wang, Qin Gao, Wei Yang, Liping Hao
Journal: Molecular Nutrition & Food Research (2017)

A Snapshot of the Plant Glycated Proteome STRUCTURAL, FUNCTIONAL, AND MECHANISTIC ASPECTS
Authors: Tatiana Bilova, Elena Lukasheva, Dominic Brauch, Uta Greifenhagen, Gagan Paudel, Elena Tarakhovskaya, Nadezhda Frolova, Juliane Mittasch, Gerd Ulrich Balcke, Alain Tissier
Journal: Journal of Biological Chemistry (2016): 7621--7636

AMPK activation protects cells from oxidative stress-induced senescence via autophagic flux restoration and intracellular NAD+ elevation
Authors: Xiaojuan Han, Haoran Tai, Xiaobo Wang, Zhe Wang, Jiao Zhou, Xiawei Wei, Yi Ding, Hui Gong, Chunfen Mo, Jie Zhang
Journal: Aging cell (2016): 416--427

 

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說明書
Amplite NAD+/NADH檢測試劑盒(熒光法) 紅色熒光.pdf


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