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Amplite NADPH檢測試劑盒(熒光法) 紅色熒光

貨號15262存儲條件 在零下15度以下保存, 避免光照
規格400 Tests價格3840
Ex (nm)571Em (nm)585
分子量溶劑
產品詳細介紹


簡要概述

Amplite NADPH檢測試劑盒(熒光法) 紅色熒光是美國AAT Bioquest研發的檢測NADPH的試劑盒,煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD +)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP +)是細胞中發現的兩種重要的輔因子。 NADH是NAD +的還原形式,NAD +是NADH的氧化形式。 NAD形成NADP,通過酯鍵將磷酸基團添加到腺苷核苷酸的2'位置。 NADP用于合成代謝生物反應,例如脂肪酸和核酸合成,其需要NADPH作為還原劑。 在葉綠體中,NADP是在光合作用的初步反應中重要的氧化劑。 通過光合作用產生的NADPH用作卡爾文光合作用循環中生物合成反應的還原能力。 傳統的NAD / NADH和NADP / NADPH測定通過監測340nm處NADH或NADPH吸收的變化來完成。 該方法具有低靈敏度和高干擾,因為該測定在需要昂貴的石英微孔板的UV范圍內進行。

這種Amplite 熒光NADPH檢測試劑盒為檢測NADPH提供了一種便捷的方法。 系統中的酶特異性識別酶再循環反應中的NADPH。 此外,該測定具有非常低的背景,因為其在紅色可見范圍內運行,這顯著降低了來自生物樣品的干擾。

Amplite 熒光NADPH檢測試劑盒提供靈敏的一步法檢測,在100μL檢測體積(1μM;圖1)中檢測少至100皮摩爾的NADPH。 該測定可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式進行,并且易于適應自動化。 其信號可通過Ex / Em = 540/590 nm的熒光酶標儀或~576 nm的吸光度酶標儀輕松讀取。 該測定試劑盒已用于篩選使用NADP / NADPH作為輔因子的酶活性。 它還被用于在基于細胞的測定中靈敏檢測NADPH。 與其他商業試劑盒相比,該試驗具有更高的信號/背景比。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商,為您提供最優質的NADPH檢測試劑盒。 

 

適用儀器


熒光酶標儀  
激發: 540nm
發射 590nm
推薦孔板: 黑色孔板


產品說明書

96孔板測定示例

概述

準備NADPH反應混合物(50μL)

加入NADPH標準品或測試樣品(50μL)

在室溫下孵育15分鐘 -  2小時在Ex / Em = 540/590 nm處

監測熒光增加

注意:在開始實驗之前,在室溫下解凍每個試劑盒組分中的一個。

 

操作方法

1.準備NADPH原液:

將200μLPBS緩沖液加入到NADPH標準品(組分C)的小瓶中以制備1mM(1nmol / L)NADPH儲備溶液。

注意:未使用的NADPH原液應分成單次使用的等分試樣并儲存在-20℃。

 

2.準備NADPH反應混合物:

將10mL Amplite™NADPH測定緩沖液(組分B)加入NADPH回收酶混合物(組分A)的瓶中,并充分混合。

注意:這種NADPH反應混合物足以用于兩個96孔板。 未使用的NADPH反應混合物應分成單次使用的等分試樣并儲存在-20℃。

 

3.準備NADPH標準品的連續稀釋液(0至100μM):

3.1將50μLNADPH儲備液(來自步驟1)加入450μLPBS緩沖液(pH 7.4)中,得到100μM(100pmol / L)NADPH標準溶液。

注意:稀釋的NADPH標準溶液不穩定,應在4小時內使用。

3.2取200μL100μMNADPH標準溶液,進行1:3連續稀釋,得到30,10,3,1,0.3,0.1和0μM的NADPH標準品系列稀釋液。

3.3如表1和2中所述,將NADPH標準品和含有NADPH的測試樣品的系列稀釋液加入到實心黑色96孔微量培養板中。

注意:根據需要準備細胞或組織樣本。

 

表1實心黑色96孔微孔板中NADPH標準品和測試樣品的布局

BL

BL

TS

TS

NS1

NS1

….

….

NS2

NS2

 

 

NS3

NS3

 

 

NS4

NS4

 

 

NS5

NS5

 

 

NS6

NS6

 

 

NS7

NS7

 

 

注意:NS = NADPH標準,BL =空白對照,TS =測試樣品

 

表2每個孔的試劑組成

NADPH Standard

Blank Control

Test Sample

Serial Dilutions*: 50 μL

PBS: 50 μL

50 μL 

*注意:將連續稀釋的NADPH標準品(0.1μM至100μM)加入NS1至NS7的孔中,一式兩份

 

4.在上清液反應中運行NADPH測定:

4.1將50μLNADPH反應混合物(來自步驟2)加入NADPH標準品,空白對照和測試樣品的每個孔中(參見步驟3.3),使總NADPH測定體積為100μL/孔。

注意:對于384孔板,每孔加入25μL樣品和25μLNADPH反應混合物。

4.2在室溫下孵育反應15分鐘至2小時,避光。

4.3在Ex / Em = 530-570 / 590-600nm((最佳Ex / Em = 540 / 590nm)下用熒光板讀數器監測熒光增加。

注意1:平板的內容物也可以轉移到白色透明底板上,用吸光度酶標儀在576±5nm波長下讀數。 與熒光讀數相比,吸收檢測具有較低的靈敏度。

注意2:對于基于細胞的NADPH測量,建議使用ReadiUse™哺乳動物細胞裂解緩沖液* 5X *(cat#20012)裂解細胞。

 

數據分析

        空白孔中的熒光(僅用PBS緩沖液)用作對照,并從具有NADPH反應的那些孔的值中減去。 NADPH標準曲線如圖1所示。

        注意:熒光背景隨時間增加,因此減去每個數據點的空白孔的熒光強度值是很重要的。

圖1.使用NOVOStar酶標儀(BMG Labtech),在96孔黑色板中用Amplite 熒光NADPH測定試劑盒測量NADPH劑量反應。 低至1μM(100pmol /孔)可以在孵育1小時(n = 3)時檢測到NADPH,而NADP沒有響應。

 

參考文獻

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說明書
Amplite NADPH檢測試劑盒(熒光法) 紅色熒光.pdf


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