Amplite NADPH檢測試劑盒(熒光法) 紅色熒光
貨號 | 15262 | 存儲條件 | 在零下15度以下保存, 避免光照 |
規格 | 400 Tests | 價格 | 3840 |
Ex (nm) | 571 | Em (nm) | 585 |
分子量 | 溶劑 | ||
產品詳細介紹 |
簡要概述
Amplite NADPH檢測試劑盒(熒光法) 紅色熒光是美國AAT Bioquest研發的檢測NADPH的試劑盒,煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD +)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP +)是細胞中發現的兩種重要的輔因子。 NADH是NAD +的還原形式,NAD +是NADH的氧化形式。 NAD形成NADP,通過酯鍵將磷酸基團添加到腺苷核苷酸的2'位置。 NADP用于合成代謝生物反應,例如脂肪酸和核酸合成,其需要NADPH作為還原劑。 在葉綠體中,NADP是在光合作用的初步反應中重要的氧化劑。 通過光合作用產生的NADPH用作卡爾文光合作用循環中生物合成反應的還原能力。 傳統的NAD / NADH和NADP / NADPH測定通過監測340nm處NADH或NADPH吸收的變化來完成。 該方法具有低靈敏度和高干擾,因為該測定在需要昂貴的石英微孔板的UV范圍內進行。
這種Amplite 熒光NADPH檢測試劑盒為檢測NADPH提供了一種便捷的方法。 系統中的酶特異性識別酶再循環反應中的NADPH。 此外,該測定具有非常低的背景,因為其在紅色可見范圍內運行,這顯著降低了來自生物樣品的干擾。
Amplite 熒光NADPH檢測試劑盒提供靈敏的一步法檢測,在100μL檢測體積(1μM;圖1)中檢測少至100皮摩爾的NADPH。 該測定可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式進行,并且易于適應自動化。 其信號可通過Ex / Em = 540/590 nm的熒光酶標儀或~576 nm的吸光度酶標儀輕松讀取。 該測定試劑盒已用于篩選使用NADP / NADPH作為輔因子的酶活性。 它還被用于在基于細胞的測定中靈敏檢測NADPH。 與其他商業試劑盒相比,該試驗具有更高的信號/背景比。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商,為您提供最優質的NADPH檢測試劑盒。
適用儀器
熒光酶標儀 | |
激發: | 540nm |
發射 | 590nm |
推薦孔板: | 黑色孔板 |
產品說明書
96孔板測定示例
概述
準備NADPH反應混合物(50μL)
加入NADPH標準品或測試樣品(50μL)
在室溫下孵育15分鐘 - 2小時在Ex / Em = 540/590 nm處
監測熒光增加
注意:在開始實驗之前,在室溫下解凍每個試劑盒組分中的一個。
操作方法
1.準備NADPH原液:
將200μLPBS緩沖液加入到NADPH標準品(組分C)的小瓶中以制備1mM(1nmol / L)NADPH儲備溶液。
注意:未使用的NADPH原液應分成單次使用的等分試樣并儲存在-20℃。
2.準備NADPH反應混合物:
將10mL Amplite™NADPH測定緩沖液(組分B)加入NADPH回收酶混合物(組分A)的瓶中,并充分混合。
注意:這種NADPH反應混合物足以用于兩個96孔板。 未使用的NADPH反應混合物應分成單次使用的等分試樣并儲存在-20℃。
3.準備NADPH標準品的連續稀釋液(0至100μM):
3.1將50μLNADPH儲備液(來自步驟1)加入450μLPBS緩沖液(pH 7.4)中,得到100μM(100pmol / L)NADPH標準溶液。
注意:稀釋的NADPH標準溶液不穩定,應在4小時內使用。
3.2取200μL100μMNADPH標準溶液,進行1:3連續稀釋,得到30,10,3,1,0.3,0.1和0μM的NADPH標準品系列稀釋液。
3.3如表1和2中所述,將NADPH標準品和含有NADPH的測試樣品的系列稀釋液加入到實心黑色96孔微量培養板中。
注意:根據需要準備細胞或組織樣本。
表1實心黑色96孔微孔板中NADPH標準品和測試樣品的布局
BL |
BL |
TS |
TS |
NS1 |
NS1 |
…. |
…. |
NS2 |
NS2 |
|
|
NS3 |
NS3 |
|
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NS4 |
NS4 |
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NS5 |
NS5 |
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NS6 |
NS6 |
|
|
NS7 |
NS7 |
|
注意:NS = NADPH標準,BL =空白對照,TS =測試樣品
表2每個孔的試劑組成
NADPH Standard |
Blank Control |
Test Sample |
Serial Dilutions*: 50 μL |
PBS: 50 μL |
50 μL |
*注意:將連續稀釋的NADPH標準品(0.1μM至100μM)加入NS1至NS7的孔中,一式兩份
4.在上清液反應中運行NADPH測定:
4.1將50μLNADPH反應混合物(來自步驟2)加入NADPH標準品,空白對照和測試樣品的每個孔中(參見步驟3.3),使總NADPH測定體積為100μL/孔。
注意:對于384孔板,每孔加入25μL樣品和25μLNADPH反應混合物。
4.2在室溫下孵育反應15分鐘至2小時,避光。
4.3在Ex / Em = 530-570 / 590-600nm((最佳Ex / Em = 540 / 590nm)下用熒光板讀數器監測熒光增加。
注意1:平板的內容物也可以轉移到白色透明底板上,用吸光度酶標儀在576±5nm波長下讀數。 與熒光讀數相比,吸收檢測具有較低的靈敏度。
注意2:對于基于細胞的NADPH測量,建議使用ReadiUse™哺乳動物細胞裂解緩沖液* 5X *(cat#20012)裂解細胞。
數據分析
空白孔中的熒光(僅用PBS緩沖液)用作對照,并從具有NADPH反應的那些孔的值中減去。 NADPH標準曲線如圖1所示。
注意:熒光背景隨時間增加,因此減去每個數據點的空白孔的熒光強度值是很重要的。
圖1.使用NOVOStar酶標儀(BMG Labtech),在96孔黑色板中用Amplite 熒光NADPH測定試劑盒測量NADPH劑量反應。 低至1μM(100pmol /孔)可以在孵育1小時(n = 3)時檢測到NADPH,而NADP沒有響應。
參考文獻
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