Amplite NADPH檢測試劑盒（熒光法） 紅色熒光

Amplite NADPH檢測試劑盒（熒光法） 紅色熒光是美國AAT Bioquest研發的檢測NADPH的試劑盒，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP +）是細胞中發現的兩種重要的輔因子。 NADH是NAD +的還原形式，NAD +是NADH的氧化形式。 NAD形成NADP，通過酯鍵將磷酸基團添加到腺苷核苷酸的2'位置。 NADP用于合成代謝生物反應，例如脂肪酸和核酸合成，其需要NADPH作為還原劑。 在葉綠體中，NADP是在光合作用的初步反應中重要的氧化劑。 通過光合作用產生的NADPH用作卡爾文光合作用循環中生物合成反應的還原能力。 傳統的NAD / NADH和NADP / NADPH測定通過監測340nm處NADH或NADPH吸收的變化來完成。 該方法具有低靈敏度和高干擾，因為該測定在需要昂貴的石英微孔板的UV范圍內進行。

這種Amplite 熒光NADPH檢測試劑盒為檢測NADPH提供了一種便捷的方法。 系統中的酶特異性識別酶再循環反應中的NADPH。 此外，該測定具有非常低的背景，因為其在紅色可見范圍內運行，這顯著降低了來自生物樣品的干擾。

Amplite 熒光NADPH檢測試劑盒提供靈敏的一步法檢測，在100μL檢測體積（1μM;圖1）中檢測少至100皮摩爾的NADPH。 該測定可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式進行，并且易于適應自動化。 其信號可通過Ex / Em = 540/590 nm的熒光酶標儀或~576 nm的吸光度酶標儀輕松讀取。 該測定試劑盒已用于篩選使用NADP / NADPH作為輔因子的酶活性。 它還被用于在基于細胞的測定中靈敏檢測NADPH。 與其他商業試劑盒相比，該試驗具有更高的信號/背景比。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商，為您提供最優質的NADPH檢測試劑盒。 

96孔板測定示例

概述

準備NADPH反應混合物（50μL）

加入NADPH標準品或測試樣品（50μL）

在室溫下孵育15分鐘 -  2小時在Ex / Em = 540/590 nm處

監測熒光增加

注意：在開始實驗之前，在室溫下解凍每個試劑盒組分中的一個。

操作方法

1.準備NADPH原液：

將200μLPBS緩沖液加入到NADPH標準品（組分C）的小瓶中以制備1mM（1nmol / L）NADPH儲備溶液。

注意：未使用的NADPH原液應分成單次使用的等分試樣并儲存在-20℃。

2.準備NADPH反應混合物：

將10mL Amplite™NADPH測定緩沖液（組分B）加入NADPH回收酶混合物（組分A）的瓶中，并充分混合。

注意：這種NADPH反應混合物足以用于兩個96孔板。 未使用的NADPH反應混合物應分成單次使用的等分試樣并儲存在-20℃。

3.準備NADPH標準品的連續稀釋液（0至100μM）：

3.1將50μLNADPH儲備液（來自步驟1）加入450μLPBS緩沖液（pH 7.4）中，得到100μM（100pmol / L）NADPH標準溶液。

注意：稀釋的NADPH標準溶液不穩定，應在4小時內使用。

3.2取200μL100μMNADPH標準溶液，進行1：3連續稀釋，得到30,10,3,1,0.3,0.1和0μM的NADPH標準品系列稀釋液。

3.3如表1和2中所述，將NADPH標準品和含有NADPH的測試樣品的系列稀釋液加入到實心黑色96孔微量培養板中。

注意：根據需要準備細胞或組織樣本。

表1實心黑色96孔微孔板中NADPH標準品和測試樣品的布局

注意：NS = NADPH標準，BL =空白對照，TS =測試樣品

表2每個孔的試劑組成

*注意：將連續稀釋的NADPH標準品（0.1μM至100μM）加入NS1至NS7的孔中，一式兩份

4.在上清液反應中運行NADPH測定：

4.1將50μLNADPH反應混合物（來自步驟2）加入NADPH標準品，空白對照和測試樣品的每個孔中（參見步驟3.3），使總NADPH測定體積為100μL/孔。

注意：對于384孔板，每孔加入25μL樣品和25μLNADPH反應混合物。

4.2在室溫下孵育反應15分鐘至2小時，避光。

4.3在Ex / Em = 530-570 / 590-600nm（（最佳Ex / Em = 540 / 590nm）下用熒光板讀數器監測熒光增加。

注意1：平板的內容物也可以轉移到白色透明底板上，用吸光度酶標儀在576±5nm波長下讀數。 與熒光讀數相比，吸收檢測具有較低的靈敏度。

注意2：對于基于細胞的NADPH測量，建議使用ReadiUse™哺乳動物細胞裂解緩沖液* 5X *（cat＃20012）裂解細胞。

數據分析

        空白孔中的熒光（僅用PBS緩沖液）用作對照，并從具有NADPH反應的那些孔的值中減去。 NADPH標準曲線如圖1所示。

        注意：熒光背景隨時間增加，因此減去每個數據點的空白孔的熒光強度值是很重要的。

圖1.使用NOVOStar酶標儀（BMG Labtech），在96孔黑色板中用Amplite 熒光NADPH測定試劑盒測量NADPH劑量反應。 低至1μM（100pmol /孔）可以在孵育1小時（n = 3）時檢測到NADPH，而NADP沒有響應。

參考文獻

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