Amplite NADP檢測試劑盒（熒光法）藍色熒光

Amplite NADP檢測試劑盒 （熒光法）藍色熒光是美國AAT Bioquest研發的檢測NADP的試劑盒，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP +）是活細胞中發現的許多酶反應的兩個重要輔助因子。 NAD形成NADP，通過酯鍵將磷酸基團添加到腺苷核苷酸的2'位置。 NADP用于合成代謝生物反應，例如脂肪酸和核酸合成，其需要NADPH作為還原劑。在葉綠體中，NADP是在光合作用的初步反應中重要的氧化劑。通過光合作用產生的NADPH用作卡爾文光合作用循環中生物合成反應的還原能力。量化這些因子的產生或消耗是監測酶介導的反應或篩選這些酶反應的調節劑或底物的重要方法。市場上有幾種用于量化NADPH或總NADP / NADPH量的試劑盒，但迄今為止在大量過量NADPH存在下檢測NADP是非常具有挑戰性的，因為NADP在260 nm處具有其吸收峰且不發熒光，使測量不實用。

Amplite 熒光NADP分析試劑盒可快速，快速地檢測NADP。該試劑盒使用我們新開發的NADP傳感器Quest Fluor NADP試劑直接測量NADP。該試劑盒中使用的專有探針僅與NADP反應產生在Ex / Em = 420 / 480nm處熒光的產物，并且對NADPH幾乎沒有響應。該試劑盒可在100μL測定體積中檢測少至30 nM NADP，并在過量NADPH存在下監測0.3％NADP產生。該測定可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式進行，并且可以用于高通量篩選。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商，為您提供最優質的NADP檢測試劑盒。 

96孔板檢測示例

概述

準備NADP標準品或測試樣品（50μL）

添加20μLQuestFluor™NADP探針

添加20μL測定溶液

在室溫下孵育10-20分鐘

添加15μL增強劑溶液

在室溫下孵育10-20分鐘，監測420/480 nm的熒光

注意：在開始實驗之前，在室溫下解凍每個試劑盒組分。

操作步驟

1.準備NADP儲備溶液：

將500μlddH2O加入到NADP標準品（組分D）的小瓶中以制備1mM NADP儲備溶液。

注意：未使用的NADP儲備溶液應分成單次使用的等分試樣并儲存在-20 ℃。

2.準備NADP標準品的連續稀釋液（0至10μM）：

2.1將10μL的NADP儲備液（來自步驟1）加入到990L H2O或PBS緩沖液中以產生10M NADP標準溶液。

注意：稀釋的NADP標準溶液不穩定，應在4小時內使用。

2.2取200μL10μMNADP標準溶液，在H2O或PBS中進行1：3連續稀釋，得到NADP標準品的10,3,1,0.3,0.1,0.03,0.01和0μM系列稀釋液。

2.3如表1所述，將50μL系列稀釋的NADP標準品和含有NADP的測試樣品加入黑色/固體底96孔微孔板中：

表1黑色/固體底部96孔微孔板中NADP標準品和測試樣品的布局

注意1：NS = NADP標準，BL =空白對照，TS =測試樣品。

注意2：將連續稀釋的NADP標準品（10μM至0.01μM）加入NS1至NS7的孔中，一式兩份。

3.運行NADP測定：

3.1將20μLQuestFluor NADP探針（組分A）溶液加入NADP標準品，空白對照品和測試樣品的每個孔中，充分混合。

3.2將20μL測定溶液（組分B）加入每個孔中，充分混合。

注意：對于384孔板，每孔加入25μL樣品和10μLQuestFluor™NADP探針和10μL分析溶液。

3.3在室溫下孵育反應10-20分鐘，避光。

3.4向每個孔中加入15μL增強劑（組分C），使總NADP測定體積為105μL/孔，并在室溫下孵育10-20分鐘，避光。

注意：對于384孔板，添加7.5 uL增強劑。

3.5使用熒光板讀數器在420/480 nm處檢測熒光增加。

數據分析

        空白孔中的熒光（僅用H 2 O或PBS緩沖液）用作對照，并從具有NADP反應的那些孔的值中減去。 NADP標準曲線如圖1所示

圖1 使用Germini酶標儀（Molecular devices），在96孔黑色/固體底板中用Amplite 熒光NADP測定試劑盒測量NADP劑量反應。 A：NADP標準曲線，在孵育20分鐘時可檢測到低至30nM的NADP（n = 3）。 B：NADP和NADPH響應的比較C：在溶液中存在100μMNADPH的NADP標準曲線。 從孵育20分鐘（n = 3）可以檢測到從NADPH轉化的低至0.3％的NADP（~300nM）。

參考文獻

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