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Amplite NADP+/NADPH檢測試劑盒(比色法)增強靈敏度

貨號15276存儲條件 在零下15度以下保存, 避免光照
規格400 Tests價格3840
Ex (nm)460Em (nm)
分子量溶劑
產品詳細介紹


簡要概述

Amplite 總NADP和NADPH檢測試劑盒 (比色法)增強靈敏度是美國AAT Bioquest研發的檢測總NADP和NADPH的試劑盒,煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD +)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP +)是細胞中發現的兩種重要的輔因子。 NADH是NAD +的還原形式。 NAD形成NADP,通過酯鍵將磷酸基團添加到腺苷核苷酸的2'位置。傳統的NAD / NADH和NADP / NADPH測定基于監測340nm處NADH或NADPH吸收的變化。 NAD / NADH和NADP / NADPH測定的短紫外波長使得傳統方法具有低靈敏度和高干擾。 AAT Bioquest的Amplite™比色總NADP / NADPH檢測試劑盒為檢測總NADP和NADPH提供了一種便捷的方法。系統中的酶特異性識別酶循環反應中的NADP / NADPH。無需從樣品混合物中純化NADP / NADPH。酶循環反應顯著提高了檢測靈敏度。 NADPH探針是一種生色傳感器,在NADP減少時具有460nm的最大吸光度。 NADPH探針的吸收與溶液中NADPH的濃度成正比。 Amplite™比色總NADP和NADPH分析試劑盒提供靈敏的分析,可在100μL分析體積中檢測低至0.03μM的總NADP / NADPH。與試劑盒#15260相比,該試劑盒具有更高的靈敏度。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商,為您提供最優質的總NADP和NADPH檢測試劑盒。 

 

適用儀器


光吸收酶標儀  
吸收: 460nm
推薦孔板: 透明底板


產品說明書

96孔板檢測示例

概述

準備NADP / NADPH反應混合物(50μL)

加入NADPH標準品或測試樣品(50μL)

在室溫下孵育15分鐘至2小時

監測460nm處的吸光度

注意:在開始實驗之前,在室溫下解凍每個試劑盒組分中的一個。

 

操作步驟

1.準備NADPH原液:

將200μLPBS緩沖液加入到NADPH標準品(組分C)的小瓶中以制備1mM(1nmol / L)NADPH儲備溶液。

注意:未使用的NADPH原液應分成單次使用的等分試樣并儲存在-20℃。

 

2.制備NADP / NADPH反應混合物:

2.1將8mL NADPH探針緩沖液(組分B-II)加入到NADP / NADPH回收酶混合物(組分A)的瓶中,并充分混合。

2.2將2 mL NADPH探針(組分B-I)加入上述瓶中(來自步驟2.1)并充分混合。

注意:這種NADP / NADPH反應混合物足以進行200次分析。未使用的NADP / NADPH反應混合物應分成一次性等分試樣并儲存在-20℃。

 

3.準備NADPH標準品的連續稀釋液(0至2μM):

3.1將2L 1mM NADPH儲備溶液(來自步驟1)加入998L PBS緩沖液(pH7.4)中,產生2M(2 pmols / L)NADPH標準溶液。

注意:稀釋的NADPH標準溶液不穩定,應在4小時內使用。

3.2取200μL2MNADPH標準溶液(來自步驟3.1)進行1:2連續稀釋,得到1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0313和0M系列稀釋的NADPH標準品。

3.3如表1和2中所述,將含有NADPH標準品和含NADP / NADPH的測試樣品的系列稀釋液加入白色/透明底96孔微量培養板中。

注意:根據需要準備細胞或組織樣本。為方便起見,裂解緩沖液(組分D)可用于裂解細胞。 (詳見附錄)。 

 

表1:白色/透明底96孔微孔板中NADPH標準品和測試樣品的布局

BL

BL

TS

TS

NS1

NS1

….

….

NS2

NS2

 

 

NS3

NS3

 

 

NS4

NS4

 

 

NS5

NS5

 

 

NS6

NS6

 

 

NS7

NS7

 

 

注意:NS = NADPH標準,BL =空白對照,TS =測試樣品

 

表2:每個孔的試劑組成

NADPH Standard

Blank Control

Test Sample

Serial Dilutions*: 50 μL

PBS: 50 μL

50 μL 

*注意:將連續稀釋的NADPH標準品(0.0313μM至2μM)加入NS1至NS7的孔中,一式兩份。 高濃度的NADPH(例如,>30μM,最終濃度)將導致飽和信號并使校準曲線非線性。

 

4.在上清液反應中運行NADPH測定:

4.1將50μL的NADP / NADPH反應混合物(來自步驟2.2)加入NADPH標準品,空白對照和測試樣品的每個孔中(參見步驟3.3),使總NADP / NADPH測定體積為100μL/孔

注意1:對于384孔板,每孔加入25μL樣品和25μLNADP/ NADPH反應混合物。

注意2:根據需要準備細胞或組織樣本。 為方便起見,裂解緩沖液(組分D)可用于裂解細胞。 (詳見附錄)。

4.2在室溫下孵育反應15分鐘至2小時,避光。

4.3用吸光度讀板儀在460 nm處檢測吸光度的增加。

 

數據分析

        空白孔中的吸光度(僅PBS緩沖液)用作對照,并從具有NADPH反應的那些孔的值中減去。

圖1 使用SpectraMax酶標儀(Molecular devices),在96孔白色/透明底板中用Amplite ™比色總NADP和NADPH測定試劑盒*增強靈敏度*測量NADPH劑量反應。孵育1小時(n = 3)可以檢測到低至0.03μM的NADPH,在460nm處測量吸光度。

 

附錄:使用組分G(NAD / NADH裂解緩沖液)的測試樣品制劑

 

1.植物細胞樣品:用200mg / mL的裂解緩沖液均質化,并以2500rpm離心5-10分鐘,使用上清液進行測試。

2.細菌細胞樣品:離心收集細菌細胞((10,000 g,℃,15 min)。使用約1億至1千萬細胞/ mL裂解緩沖液,將處理后的溶液在室溫下保持15分鐘.2500℃離心 轉速5分鐘,并用上清液進行試驗。

3.哺乳動物細胞樣品:從平板孔中取出培養基,每1-5百萬個細胞使用約100μL裂解緩沖液(或在96孔細胞培養板中使用50-100μL/孔),并將處理過的溶液保持在室溫下 15分鐘。 直接使用細胞裂解液或以1500 rpm離心5分鐘,使用上清液進行測試。

4.組織樣品:稱取約20mg組織,用冷PBS洗滌。 在微量離心管中用400μl裂解緩沖液均化。 以2500rpm離心5-10分鐘,使用上清液進行測定。

 

參考文獻

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Amplite NADP+/NADPH檢測試劑盒(比色法) Cat#15260
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Amplite NADPH檢測試劑盒(比色法) Cat#15272


說明書
Amplite NADP+/NADPH檢測試劑盒(比色法)增強靈敏度.pdf


欧美精品黑人粗大
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