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Amplite NAD+/NADH檢測試劑盒(比色法)增強靈敏度

貨號15275存儲條件 在零下15度以下保存, 避免光照
規格400 Tests價格3840
Ex (nm)460Em (nm)
分子量溶劑
產品詳細介紹


簡要概述

Amplite 總NAD和NADH檢測試劑盒 (比色法)增強靈敏度是美國AAT Bioquest研發的檢測總NAD和NADH的試劑盒,煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD +)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP +)是細胞中發現的兩種重要的輔因子。 NADH是NAD +的還原形式。 NAD形成NADP,通過酯鍵將磷酸基團添加到腺苷核苷酸的2'位置。傳統的NAD / NADH和NADP / NADPH測定基于監測340nm處NADH或NADPH吸收的變化。 NAD / NADH和NADP / NADPH測定的短紫外波長使得傳統方法具有低靈敏度和高干擾。 AAT Bioquest的Amplite 比色總NAD / NADH檢測試劑盒為檢測總NAD和NADH提供了一種便捷的方法。系統中的酶特異性識別酶循環反應中的NAD / NADH。無需從樣品混合物中純化NAD / NADH。酶循環反應顯著提高了檢測靈敏度。 NADH探針是一種生色傳感器,在NADH減少時具有460nm的最大吸光度。 NADH探針的吸收與溶液中NADH的濃度成正比。 Amplite™比色法總NAD和NADH分析試劑盒提供靈敏的分析,可在100μL分析體積中檢測低至0.1μM的總NAD / NADH。與試劑盒15258相比,該試劑盒具有更高的靈敏度。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商,為您提供最優質的總NAD和NADP檢測試劑盒。

 

適用儀器


光吸收酶標儀  
吸收: 460nm
推薦孔板: 透明底板


產品說明書

96孔板檢測示例

概述

準備NAD / NADH反應混合物(50μL)

加入NADH標準品或測試樣品(50μL)

在室溫下孵育15分鐘至2小時

監測460 nm處的吸光度

注意:在開始實驗之前,在室溫下解凍每個試劑盒組分中的一個。

 

操作步驟

1.準備NADH儲備溶液:

將200μLPBS緩沖液加入到NADH標準品(組分C)的小瓶中以制備1mM(1nmol / L)NADH儲備溶液。

注意:未使用的NADH儲備溶液應分成單次使用的等分試樣并儲存在-20 ℃。

 

2.準備NAD / NADH反應混合物:

2.1將8 mL NADH探針緩沖液(組分B-II)加入到NAD / NADH回收酶混合物(組分A)的瓶中,并充分混合。

2.2將2 mL NADH探針(組分B-I)加入上述瓶中(來自步驟2.1)并充分混合。

注意:這種NAD / NADH反應混合物足以進行200次分析。未使用的NAD / NADH反應混合物應分成一次性等分試樣并儲存在-20℃。

 

3.準備NADH標準品的系列稀釋液(0至10μM):

3.1將10μL1mMNADH儲備溶液(來自步驟1)加入990L PBS緩沖液(pH7.4)中,得到10μM(10pmol / L)NADH標準溶液。

注意:稀釋的NADH標準溶液不穩定,應在4小時內使用。

3.2取200μL10M NADH標準溶液(來自步驟3.1)進行1:2連續稀釋,得到5,2.5,1.25,0.625,0.313,0.156,0.078和0 M系列稀釋的NADH標準品。

3.3如表1和2中所述,將含有NADH標準品和含NAD / NADH的測試樣品的系列稀釋液加入白色/透明底96孔微量培養板中。

注意:根據需要準備細胞或組織樣本。

 

表1:白色/透明底96孔微孔板中NADH標準品和測試樣品的布局

BL

BL

TS

TS

NS1

NS1

….

….

NS2

NS2

 

 

NS3

NS3

 

 

NS4

NS4

 

 

NS5

NS5

 

 

NS6

NS6

 

 

NS7

NS7

 

 

注意:NS = NADH標準,BL =空白對照,TS =測試樣品

 

表2:每個孔的試劑組成

NADH Standard

Blank Control

Test Sample

Serial Dilutions*: 50 μL

PBS: 50 μL

50 μL 

*注意:將連續稀釋的NADH標準品(0.078μM至5μM)加入NS1至NS7的孔中,一式兩份。 高濃度的NADH(例如,>100μM,最終濃度)將導致飽和信號并使校準曲線非線性。

 

4.在上清液反應中運行NADH測定:

4.1將50μLNAD/ NADH反應混合物(來自步驟2.2)加入NADH標準品,空白對照和測試樣品的每個孔中(參見步驟3.3),使總NAD / NADH測定體積為100μL/孔

注意1:對于384孔板,每孔加入25μL樣品和25μLNADH反應混合物。

注意2:根據需要準備細胞或組織樣本。 為方便起見,裂解緩沖液(組分D)可用于裂解細胞。

4.2在室溫下孵育反應15分鐘至2小時,避光。

4.3用吸光度讀板儀在460 nm處檢測吸光度的增加。

 

數據分析

        空白孔中的吸光度(僅用PBS緩沖液)用作對照,并從具有NADH反應的那些孔的值中減去。 NADH標準曲線如圖1所示。

圖1. Amplite™比色NADP / NADPH比率分析試劑盒用于使用SpectraMax酶標儀(Molecular devices)測量白色/透明96孔微量培養板中的總NADP / NADPH量和NADP / NADPH比率。

A-總NADPH和NADP劑量反應:孵育1小時可檢測到低至0.03μM的總NADPH。

B-NADP / NADPH比例:用或不用NADP提取溶液處理等量的NADP和NADPH混合物15分鐘,然后在室溫下用提取溶液中和。 在460nm讀取信號。 NADP / NADPH摩爾比基于圖1B中所示的吸光度計算。

 

附錄:使用組分G(NAD / NADH裂解緩沖液)的測試樣品制劑

1.植物細胞樣品:

用裂解緩沖液以200mg / mL均化,并以2500rpm離心5-10分鐘,使用上清液進行測試。

 

2.細菌樣品:

離心收集細菌細胞((10,000 g,0°C,15 min)。使用約1億至1千萬細胞/ mL裂解緩沖液,將處理后的溶液在室溫下保持15分鐘。以2500 rpm離心5分鐘, 用上清液進行試驗。

 

3.哺乳動物細胞樣本:

從平板孔中取出培養基,每1-5百萬個細胞使用約100μL裂解緩沖液(或在96孔細胞培養板中使用50-100μL/孔),并將處理過的溶液在室溫下保持15分鐘。 直接使用細胞裂解液或以1500 rpm離心5分鐘,使用上清液進行測試。

 

4.組織樣品:

稱取約20mg組織,用冷PBS洗滌。 在微量離心管中用400μl裂解緩沖液均化。 以2500rpm離心5-10分鐘,使用上清液進行測定。

 

參考文獻

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Amplite NAD+/NADH檢測試劑盒(比色法) Cat#15258
Amplite NAD+/NADH檢測試劑盒(熒光法) 紅色熒光 Cat#15257
Amplite NADH檢測試劑盒(熒光法) 紅色熒光 Cat#15261


說明書
Amplite NAD+/NADH檢測試劑盒(比色法)增強靈敏度.pdf


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