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Amplite NAD+/NADH檢測試劑盒(比色法)

貨號15258存儲條件 在零下15度以下保存, 避免光照
規格400 Tests價格3840
Ex (nm)575Em (nm)
分子量溶劑
產品詳細介紹


簡要概述

Amplite NAD+/NADH檢測試劑盒(比色法)是AAT Bioquest研發的檢測NAD+/NADH的試劑盒。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD +)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP +)是細胞中發現的兩種重要的輔因子。 NADH是NAD +的還原形式,NAD +是NADH的氧化形式。 NAD形成NADP,通過酯鍵將磷酸基團添加到腺苷核苷酸的2'位置。 NADP用于合成代謝生物反應,例如脂肪酸和核酸合成,其需要NADPH作為還原劑。 在葉綠體中,NADP是在光合作用的初步反應中重要的氧化劑。 通過光合作用產生的NADPH用作卡爾文光合作用循環中生物合成反應的還原能力。

傳統的NAD / NADH和NADP / NADPH測定通過監測340nm處NADH或NADPH吸收的變化來進行。 Amplite™熒光總NAD和NADH檢測試劑盒為敏感檢測NAD和NADH提供了一種便捷的方法。 系統中的酶特異性識別酶循環反應中的NAD / NADH,其顯著提高了檢測靈敏度。 此外,該測定具有非常低的背景,因為其在紅色可見范圍內運行,這顯著降低了生物樣品引起的干擾。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商,為您提供最優質的Amplite NAD+/NADH檢測試劑盒。 

Amplite 比色NAD / NADH檢測試劑盒提供靈敏的一步法檢測,可在100μL檢測體積(300 nM;圖1)中檢測少至30皮摩爾的NAD(H)。 可以以方便的96孔或384孔板進行檢測。 其信號可通過光吸收酶標儀在~575nm或~570nm至~605nm的吸光度比下輕松讀取,以提高測定靈敏度。

 

適用儀器


光吸收酶標儀  
吸收: 570/610nm
推薦孔板: 透明底板


產品說明書

96孔板測定示例

概述

準備NAD / NADH反應混合物(50μL)

添加NADH標準品或測試樣品(50μL)

在室溫下孵育15分鐘--2小時

檢測Ex / Em = 540 / 590nm處的熒光強度

 

操作方法

1.準備NADH儲備溶液:

將200μLPBS緩沖液加入到NADH標準品(組分C)的小瓶中,得到1mM(1nmol / L)NADH儲備溶液。

注意:未使用的NADH儲備溶液應分成單次使用的等分試樣并儲存在-20℃。

2.準備NAD / NADH反應混合物:

將10mL NAD / NADH緩沖液(組分B)加入NAD / NADH再循環酶混合物(組分A)的瓶中,并充分混合。

注意:NAD / NADH反應混合物足以用于兩個96孔板。 未使用的NAD / NADH反應混合物應分成一次性等分試樣并儲存在-20℃。

3.準備NADH標準品的系列稀釋液(0至10μM):

3.1將10μL的NADH儲備溶液(來自步驟1)加入到990L PBS緩沖液(pH 7.4)中,以產生10μM(10pmol / L)NADH標準溶液。

注意:稀釋的NADH標準溶液不穩定,應在4小時內使用。

3.2取200μL 10μM NADH標準溶液進行1:3連續稀釋,得到NADH標準品的3,1,0.3,0.1,0.03,0.01和0μM連續稀釋液。

3.3如表1和2中所述,將含有NADH標準品和含NAD / NADH的測試樣品的系列稀釋液加入到黑色96孔板中。

注意:根據需要準備細胞或組織樣本。

 

表1黑色96孔板中NADH標準品和測試樣品的布局

BL

BL

TS

TS

NS1

NS1

….

….

NS2

NS2

 

 

NS3

NS3

 

 

NS4

NS4

 

 

NS5

NS5

 

 

NS6

NS6

 

 

NS7

NS7

 

 

注意:NS = NADH標準,BL =空白對照,TS =測試樣品。

 

表2.每個孔的試劑組成

NADH Standard

Blank Control

Test Sample

Serial Dilutions*: 50 μL

PBS: 50 μL

50 μL 

注意:將連續稀釋的NADH標準品(0.01μM至10μM)加入NS1至NS7的孔中,一式兩份。 高濃度的NADH(例如,>100μM,最終濃度)可能由于NADH探針(對非熒光產物)的過度氧化而導致熒光信號降低。

 

4.在上清液反應中運行NAD / NADH測定:

4.1將50μL的NADH反應混合物(來自步驟2)加入NADH標準品,空白對照和測試樣品(來自步驟3.3)的每個孔中,使得總NADH測定體積為100μL/孔。

注意:對于384孔板,每孔加入25μL樣品和25μLNADH反應混合物。

4.2在室溫下孵育反應15分鐘至2小時,避光。

4.3用Ex / Em = 540 / 590nm的熒光酶標儀檢測熒光。

注1:也可將板的混合物轉移到白色透明底板上,用吸光度酶標儀在576±5nm波長下讀數。 與熒光讀數相比,吸收檢測具有較低的靈敏度。

注意2:對于NAD / NADH比率測量,建議使用試劑盒15263。

注意3:對于細胞的NAD / NADH檢測,建議使用ReadiUse 哺乳動物細胞裂解緩沖液* 5X *(貨號:20012)裂解細胞。

 

數據分析

        空白孔中的熒光(僅用PBS緩沖液)用作對照,并從具有NADH反應的那些孔的值中減去。 NADH標準曲線如圖1所示。

注意:熒光背景隨時間增加,因此減去每個數據點的空白孔的熒光強度值是很重要的。

圖1.使用NOVOStar酶標儀(BMG Labtech),在黑色96孔板中用Amplite 總NAD和NADH測定試劑盒測量NADH劑量反應。 在孵育1小時(n = 3)時可以檢測到低至100nM(10pmol /孔)的NADH,而NADPH沒有響應。

 

試劑應用文獻

AMPK activation protects cells from oxidative stress-induced senescence via autophagic flux restoration and intracellular NAD+ elevation
Authors: Han, Xiaojuan and Tai, Haoran and Wang, Xiaobo and Wang, Zhe and Zhou, Jiao and Wei, Xiawei and Ding, Yi and Gong, Hui and Mo, Chunfen and Zhang, Jie and others
Journal: Aging cell (2016): 416--427

 

參考文獻

Reduction of renal tubular injury with a RAGE inhibitor FPS-ZM1, valsartan and their combination in streptozotocin-induced diabetes in the rat
Authors: Davoud Sanajou, Amir Ghorbani Haghjo, Hassan Argani, Leila Roshangar, Nadereh Rashtchizadeh, Saeed Nazari Soltan Ahmad, Zahra Ashrafi-Jigheh, Saman Bahrambeigi, Farshid Asiaee, Jalil Rashedi
Journal: European journal of pharmacology (2019): 40--48

Functional analysis of the mitochondrial alternative oxidase gene (aox1) from Aspergillus niger CGMCC 10142 and its effects on citric acid production
Authors: Li Hou, Ling Liu, Hongfei Zhang, Lin Zhang, Lan Zhang, Jian Zhang, Qiang Gao, Depei Wang
Journal: Applied microbiology and biotechnology (2018): 1--15

Celastrol attenuates angiotensin II mediated human umbilical vein endothelial cells damage through activation of Nrf2/ERK1/2/Nox2 signal pathway
Authors: Miao Li, Xin Liu, Yongpeng He, Qingyin Zheng, Min Wang, Yu Wu, Yuanpeng Zhang, Chaoyun Wang
Journal: European Journal of Pharmacology (2017): 124--133

Cytosolic Redox Status of Wine Yeast (Saccharomyces Cerevisiae) under Hyperosmotic Stress during Icewine Fermentation
Authors: Fei Yang, Caitlin Heit, Debra L Inglis
Journal: Fermentation (2017): 61

Epigenetic regulation of Runx2 transcription and osteoblast differentiation by nicotinamide phosphoribosyltransferase
Authors: Min Ling, Peixin Huang, Shamima Islam, Daniel P Heruth, Xuanan Li, Li Qin Zhang, Ding-You Li, Zhaohui Hu, Shui Qing Ye
Journal: Cell & Bioscience (2017): 27

MCU-dependent mitochondrial Ca2+ inhibits NAD+/SIRT3/SOD2 pathway to promote ROS production and metastasis of HCC cells
Authors: T Ren, H Zhang, J Wang, J Zhu, M Jin, Y Wu, X Guo, L Ji, Q Huang, H Yang
Journal: Oncogene (2017)

Metabolic and molecular insights into an essential role of nicotinamide phosphoribosyltransferase
Authors: Li Q Zhang, Leon Van Haandel, Min Xiong, Peixin Huang, Daniel P Heruth, Charlie Bi, Roger Gaedigk, Xun Jiang, Ding-You Li, Gerald Wyckoff
Journal: Cell Death & Disease (2017): e2705

Pyrroloquinoline Quinone, a Redox-active o-Quinone, Stimulates Mitochondrial Biogenesis by Activating SIRT1/PGC-1α Signaling Pathway
Authors: Kazuhiro Saihara, Ryosuke Kamikubo, Kazuto Ikemoto, Koji Uchida, Mitsugu Akagawa
Journal: Biochemistry (2017)

Resveratrol attenuates excessive ethanol exposure induced insulin resistance in rats via improving NAD+/NADH ratio
Authors: Gang Luo, Bingqing Huang, Xiang Qiu, Lin Xiao, Ning Wang, Qin Gao, Wei Yang, Liping Hao
Journal: Molecular Nutrition & Food Research (2017)

A Snapshot of the Plant Glycated Proteome STRUCTURAL, FUNCTIONAL, AND MECHANISTIC ASPECTS
Authors: Tatiana Bilova, Elena Lukasheva, Dominic Brauch, Uta Greifenhagen, Gagan Paudel, Elena Tarakhovskaya, Nadezhda Frolova, Juliane Mittasch, Gerd Ulrich Balcke, Alain Tissier
Journal: Journal of Biological Chemistry (2016): 7621--7636

 

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產品名稱 貨號
Amplite NAD+/NADH檢測試劑盒(比色法)增強靈敏度 Cat#15275
Amplite NAD+/NADH檢測試劑盒(熒光法) 紅色熒光 Cat#15257
Amplite NADH檢測試劑盒(熒光法) 紅色熒光 Cat#15261


說明書
Amplite NAD+/NADH檢測試劑盒(比色法).pdf


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