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Amplite NADP/NADPH比率檢測試劑盒(比色法)

貨號15274存儲條件 在零下15度以下保存, 避免光照
規格250 Tests價格4488
Ex (nm)460Em (nm)
分子量溶劑
產品詳細介紹


簡要概述

Amplite NADP/NADPH比率檢測試劑盒 (比色法)是美國AAT Bioquest研發的檢測NADP/NADPH的試劑盒,煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)是細胞中發現的兩種重要的輔酶。 NAD形成NADP,通過酯鍵將磷酸基團添加到腺苷核苷酸的2'位置。 NADH(NADPH)是NAD(NADP)的還原形式,NAD(NADP)是NADH(NADPH)的氧化形式。 NAD或NADP在氧化還原反應中起輔助因子的作用,在細胞反應中轉移電子。 氧化形式和還原形式之間的平衡是NAD / NADH(NADP / NADPH)比率。 該比率是指示細胞氧化還原狀態的重要組分,并且它是反映代謝活性和細胞健康的測量。 在健康的哺乳動物組織中,游離NAD和NADH之間的比率的估計可以高達700。相反,NADP / NADPH比率通常為約0.005,因此NADPH是該輔酶的主要形式。

該Amplite 比色NADP / NADPH比率分析試劑盒提供了一種比色法,用于測量培養細胞中細胞內總NADP / NADPH量和NADP / NADPH比率。 在該測定中,裂解物中的NADPH可以用NADPH提取溶液提取,然后通過NADPH探針識別,在反應后得到黃色染料,其在460nm處具有吸光度。 產生的染料量與細胞裂解物中NADP或NADPH的濃度成正比,可用作細胞NADP / NADPH濃度的指示劑。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商,為您提供最優質的NADP/NADPH檢測試劑盒。 

 

適用儀器


光吸收酶標儀  
吸收: 460nm
推薦孔板: 透明底板


產品說明書

96孔板檢測示例

概述

準備25μLNADPH標準品和/或測試樣品

加入25μLNADPH提取液

在室溫下孵育15分鐘

加入25μL中和溶液

加入75μLNADPP/ NADPH反應混合物在室溫下孵育15分鐘至2小時監測 在460nm處的吸光度

注意:在開始實驗之前,在室溫下解凍每個試劑盒組分中的一個。

 

操作步驟

1.準備NADPH原液:

將200μLPBS緩沖液加入到NADPH標準品(組分C)的小瓶中,得到1mM(1nmol / L)NADPH儲備溶液。

注意:未使用的NADPH原液應分成單次使用的等分試樣并儲存在-20℃。

 

2.制備NADP / NADPH反應混合物:

2.1將8mL NADPH探針緩沖液(組分B-II)加入到NADP / NADPH回收酶混合物(組分A)的瓶中,并充分混合。

2.2將2 mL NADPH探針(組分B-I)加入上述瓶中(來自步驟2.1)并充分混合。

注意:這種NADP / NADPH反應混合物足以進行125~200次分析。 未使用的NADP / NADPH反應混合物應分成一次性等分試樣并儲存在-20℃。

 

3.準備連續稀釋的NADPH標準品(0至2μM):

3.1將2L 1mM NADPH儲備溶液(來自步驟1)加入998L PBS緩沖液(pH7.4)中,產生2M(2 pmols / L)NADPH標準溶液。

注意:稀釋的NADPH標準溶液不穩定,應在4小時內使用。

3.2取200μL2MNADPH標準溶液(來自步驟3.1)進行1:2連續稀釋,得到1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0313和0M系列稀釋的NADPH標準品。

 

4.運行總NADP / NADPH分析(總共400個分析/試劑盒):

4.1如說明書中的表1和2中所述,將NADPH標準品和含有NADP / NADPH的測試樣品的系列稀釋液加入白色/透明底96孔微孔板中。

注意:根據需要準備細胞或組織樣本。 為方便起見,裂解緩沖液(組分G)可用于裂解細胞。 (詳見附錄)。

4.2將50μL的NADP / NADPH反應混合物(來自步驟2.2)加入NADPH標準品,空白對照和測試樣品(來自步驟4.1)的每個孔中,以使總NADP / NADPH測定體積為100μL/孔。

4.3在室溫下孵育反應15分鐘至2小時,避光。

4.4使用吸光度讀板儀在460 nm處檢測吸光度的增加。

 

5.運行NADP / NADPH比率分析(總共250個分析/試劑盒):

5.1如說明書中的表3和4中所述,將連續稀釋的NADPH標準品和/或含NADP / NADPH的測試樣品加入白色/透明96孔微量培養板中。

注意:根據需要準備細胞或組織樣本。 為方便起見,裂解緩沖液(組分G)可用于裂解細胞。

5.2對于NADPH提?。∟ADPH量):將25μLNADPH提取溶液(組分D)加入含有NADP / NADPH的測試樣品的孔中。在室溫下孵育10至15分鐘,然后加入25μL中和溶液(組分E)以中和NADPH提取物,如說明書中的表3和4中所述。

對于總NADP和NADPH(總量):將25μLNADPP/ NADPH對照溶液(組分F)加入NADPH標準品的孔和含有NADP / NADPH的測試樣品中。在室溫下孵育10至15分鐘,然后如說明書中的表3和4中所述添加25μL提取對照溶液(組分F)。

注意:根據需要準備細胞或組織樣本。為方便起見,裂解緩沖液(組分G)可用于裂解細胞(詳見附錄)。

 

5.3將75μL的NADP / NADPH反應混合物(來自步驟2.2)加入NADPH標準品,空白對照和測試樣品(NADP / NADPH)的每個孔中,并測試樣品(NADPH提取物)(來自步驟5.1)以使總量達到測定體積為150μL/孔。

5.4在室溫下孵育反應15分鐘至2小時,避光。

5.5使用吸光度讀板儀在460 nm處檢測吸光度的增加。

 

數據分析

        空白孔中的吸光度(僅PBS緩沖液)用作對照,并從具有NADPH反應的那些孔的值中減去。

圖1. Amplite™比色NADP / NADPH比率分析試劑盒用于使用SpectraMax酶標儀(Molecular devices)測量白色/透明96孔微量培養板中的總NADP / NADPH量和NADP / NADPH比率。

A-總NADPH和NADP劑量反應:孵育1小時可檢測到低至0.03μM的總NADPH。

B-NADP / NADPH比例:用或不用NADP提取溶液處理等量的NADP和NADPH混合物15分鐘,然后在室溫下用提取溶液中和。 在460nm讀取信號。 NADP / NADPH摩爾比基于圖1B中所示的吸光度計算。

 

附錄:使用組分G(NAD / NADH裂解緩沖液)的測試樣品制劑

1.植物細胞樣品:

用裂解緩沖液以200mg / mL均化,并以2500rpm離心5-10分鐘,使用上清液進行測試。

 

2.細菌樣品:

離心收集細菌細胞((10,000 g,0°C,15 min)。使用約1億至1千萬細胞/ mL裂解緩沖液,將處理后的溶液在室溫下保持15分鐘。以2500 rpm離心5分鐘, 用上清液進行試驗。

 

3.哺乳動物細胞樣本:

從平板孔中取出培養基,每1-5百萬個細胞使用約100μL裂解緩沖液(或在96孔細胞培養板中使用50-100μL/孔),并將處理過的溶液在室溫下保持15分鐘。 直接使用細胞裂解液或以1500 rpm離心5分鐘,使用上清液進行測試。

 

4.組織樣品:

稱取約20mg組織,用冷PBS洗滌。 在微量離心管中用400μl裂解緩沖液均化。 以2500rpm離心5-10分鐘,使用上清液進行測定。

 

試劑應用文獻

Impact of Genetic Reduction of NMNAT2 on Chemotherapy-Induced Losses in Cell Viability In Vitro and Peripheral Neuropathy In Vivo
Authors: 
Slivicki, Richard A and Ali, Yousuf O and Lu, Hui-Chen and Hohmann, Andrea G
Journal: 
PloS one (2016): e0147620

NMNAT2: HSP90 Complex Mediates Proteostasis in Proteinopathies
Authors: Ali, Yousuf O and Allen, Hunter M and Yu, Lei and Li-Kroeger, David and Bakhshizadehmahmoudi, Dena and Hatcher, Asante and McCabe, Cristin and Xu, Jishu and Bjorklund, Nicole and Taglialatela, Giulio and others
Journal: PLoS Biol (2016): e1002472

ACLY and ACC1 Regulate Hypoxia-Induced Apoptosis by Modulating ETV4 via α-ketoglutarate
Authors: Keenan, Melissa M and Liu, Beiyu and Tang, Xiaohu and Wu, Jianli and Cyr, Derek and Stevens, Robert D and Ilkayeva, Olga and Huang, Zhiqing and Tollini, Laura A and Murphy, Susan K and others
Journal: PLoS Genet (2015): e1005599

Analysis of the nicotinamide phosphoribosyltransferase family provides insight into vertebrate adaptation to different oxygen levels during the water-to-land transition
Authors: Fang, Chengchi and Guan, Lihong and Zhong, Zaixuan and Gan, Xiaoni and He, Shunping
Journal: FEBS journal (2015): 2858--2878

Metformin-induced energy deficiency leads to the inhibition of lipogenesis in prostate cancer cells
Authors: Loubière, Camille and Goiran, Thomas and Laurent, Kathiane and Djabari, Zied and Tanti, Jean-Fran?ois and Bost, Frédéric
Journal: Oncotarget (2015): 15652

Prediction of intracellular metabolic states from extracellular metabolomic data
Authors: Aurich, Maike K and Paglia, Giuseppe and Rolfsson, Ottar and Hrafnsdóttir, Sigrún and Magnúsdóttir, Manuela and Stefaniak, Magdalena M and Palsson, Bernhard O and Fleming, Ronan MT and Thiele, Ines
Journal: Metabolomics (2015): 603--619

 

參考文獻

Enhanced metabolic activities for ATP production and elevated metabolic flux via pentose phosphate pathway contribute for better CIK cells expansion
Authors: Weiwei Zhang, Huimin Huang, Haibo Cai, Wen-Song Tan
Journal: Cell proliferation (2019)

Soluble α-Klotho treatment protects adenine-induced uremia rats from sciatic nerve damage
Authors: Yingdan Zhao, Jun Ma, Bo Gu, Yang Yi, Hanqing Wang, Zhiyong Guo
Journal: Biomedical Research (2018)

Celastrol attenuates angiotensin II mediated human umbilical vein endothelial cells damage through activation of Nrf2/ERK1/2/Nox2 signal pathway
Authors: Miao Li, Xin Liu, Yongpeng He, Qingyin Zheng, Min Wang, Yu Wu, Yuanpeng Zhang, Chaoyun Wang
Journal: European Journal of Pharmacology (2017): 124--133

Cytosolic Redox Status of Wine Yeast (Saccharomyces Cerevisiae) under Hyperosmotic Stress during Icewine Fermentation
Authors: Fei Yang, Caitlin Heit, Debra L Inglis
Journal: Fermentation (2017): 61

Epigenetic regulation of Runx2 transcription and osteoblast differentiation by nicotinamide phosphoribosyltransferase
Authors: Min Ling, Peixin Huang, Shamima Islam, Daniel P Heruth, Xuanan Li, Li Qin Zhang, Ding-You Li, Zhaohui Hu, Shui Qing Ye
Journal: Cell & Bioscience (2017): 27

MCU-dependent mitochondrial Ca2+ inhibits NAD+/SIRT3/SOD2 pathway to promote ROS production and metastasis of HCC cells
Authors: T Ren, H Zhang, J Wang, J Zhu, M Jin, Y Wu, X Guo, L Ji, Q Huang, H Yang
Journal: Oncogene (2017)

Metabolic and molecular insights into an essential role of nicotinamide phosphoribosyltransferase
Authors: Li Q Zhang, Leon Van Haandel, Min Xiong, Peixin Huang, Daniel P Heruth, Charlie Bi, Roger Gaedigk, Xun Jiang, Ding-You Li, Gerald Wyckoff
Journal: Cell Death & Disease (2017): e2705

Pyrroloquinoline Quinone, a Redox-active o-Quinone, Stimulates Mitochondrial Biogenesis by Activating SIRT1/PGC-1α Signaling Pathway
Authors: Kazuhiro Saihara, Ryosuke Kamikubo, Kazuto Ikemoto, Koji Uchida, Mitsugu Akagawa
Journal: Biochemistry (2017)

Resveratrol attenuates excessive ethanol exposure induced insulin resistance in rats via improving NAD+/NADH ratio
Authors: Gang Luo, Bingqing Huang, Xiang Qiu, Lin Xiao, Ning Wang, Qin Gao, Wei Yang, Liping Hao
Journal: Molecular Nutrition & Food Research (2017)

A Snapshot of the Plant Glycated Proteome STRUCTURAL, FUNCTIONAL, AND MECHANISTIC ASPECTS
Authors: Tatiana Bilova, Elena Lukasheva, Dominic Brauch, Uta Greifenhagen, Gagan Paudel, Elena Tarakhovskaya, Nadezhda Frolova, Juliane Mittasch, Gerd Ulrich Balcke, Alain Tissier
Journal: Journal of Biological Chemistry (2016): 7621--7636

 

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說明書
Amplite NADP/NADPH比率檢測試劑盒(比色法).pdf


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