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Amplite NADH檢測試劑盒(比色法)

貨號15271存儲條件 在零下15度以下保存, 避免光照
規格400 Tests價格3192
Ex (nm)460Em (nm)
分子量溶劑
產品詳細介紹


簡要概述

Amplite NADH檢測試劑盒(比色法)是美國AAT Bioquest研發的檢測NADH的試劑盒,煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD +)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP +)是細胞中發現的兩種重要的輔因子。 NADH是NAD +的還原形式。 NAD形成NADP,通過酯鍵將磷酸基團添加到腺苷核苷酸的2'位置。 傳統的NAD / NADH和NADP / NADPH測定基于監測340nm處NADH或NADPH吸收的變化。 NAD / NADH和NADP / NADPH測定的短紫外波長使得傳統方法具有低靈敏度和高干擾。 AAT Bioquest的Amplite 比色NADH檢測試劑盒為檢測NADH提供了一種便捷的方法。 NADH探針是一種生色傳感器,在NADH減少時具有460nm的最大吸光度。 NADH探針的吸收與溶液中NADH的濃度成正比。 Amplite 比色NADH分析試劑盒提供靈敏的分析,可在100μL分析體積中檢測低至3μM的NADH。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商,為您提供最優質的NADH檢測試劑盒。 

 

適用儀器


光吸收酶標儀  
吸收: 460nm
推薦孔板: 透明底板


產品說明書

96孔板檢測示例

概述

準備NADH反應混合物(50μL)

加入NADH標準品或測試樣品(50μL)

在室溫下孵育持續15分鐘至2小時

監測460nm處的吸光度

注意:在開始實驗之前,在室溫下解凍每個試劑盒組分中的一個

 

操作步驟

1.準備NADH儲備溶液:

將200μLPBS緩沖液加入到NADH標準品(組分C)的小瓶中以制備1mM(1nmol / L)NADH儲備溶液。

注意:未使用的NADH儲備溶液應分成單次使用的等分試樣并儲存在-20℃。

 

2.準備NADH反應混合物:

將1mL NADH探針(組分A)加入4mL NADH測定緩沖液(組分B)中,并充分混合。

注意:5mL NADH反應混合物用于一個96孔。未使用的NADH反應混合物應分成單次使用的等分試樣并儲存在-20℃。

 

3.準備NADH標準品的系列稀釋液(0至100μM):

3.1將100μL的NADH儲備溶液(來自步驟1)加入到400μLPBS緩沖液(pH 7.4)中,以產生200μM(100pmol / L)NADH標準溶液。 注意:稀釋的NADH標準溶液不穩定,應在4小時內使用。

3.2取200μL的200μMNADH標準溶液進行1:2連續稀釋,得到NADH標準品的100,50,25,12.5,6.25,3.13和0μM連續稀釋液。

3.3如表1和2所述,將NADH標準品和含有NADH的測試樣品的系列稀釋液加入白色/透明底96孔板中。

注意:根據需要制備細胞或組織樣品。

 

表1.白色/透明底96孔微孔板中NADH標準品和測試樣品的布局

BL

BL

TS

TS

NS1

NS1

….

….

NS2

NS2

 

 

NS3

NS3

 

 

NS4

NS4

 

 

NS5

NS5

 

 

NS6

NS6

 

 

NS7

NS7

 

 

注意:NS = NADH標準,BL =空白對照,TS =測試樣品。

 

表2.每個孔的試劑

體積 試劑
NS1 - NS7 50 µL 連續稀釋 (3.13 to 200 µM)
BL 50 µL PBS
TS 50 µL 測試樣品

*注意:將連續稀釋的NADH標準品(3.13μM至200μM)加入NS1至NS7的孔中,一式兩份。

 

4.在上清液反應中運行NADH測定:

4.1將50μL的NADH反應混合物(來自步驟2)加入NADH標準品,空白對照和測試樣品的每個孔中(參見步驟3.3),使總NADH測定體積為100μL/孔

注意1:對于384孔板,每孔加入25μL樣品和25μLNADH反應混合物。

注意2:根據需要準備細胞或組織樣本。 為方便起見,裂解緩沖液(組分D)可用于裂解細胞。(詳見附錄)。

4.2在室溫下孵育反應15分鐘至2小時,避光。

4.3用吸光度讀板儀在460 nm處檢測吸光度的增加。

 

數據分析

        空白孔中的吸光度(僅用PBS緩沖液)用作對照,并從具有NADH反應的那些孔的值中減去。 NADH標準曲線如圖1所示。

圖1。 使用SpectraMax酶標儀(Molecular devices),在96孔白色/透明底板中用Amplite ™比色NADH測定試劑盒測量NADH劑量反應。 孵育30分鐘(n = 3)可以檢測到低至3μM的NADH,在460nm處測量吸光度。

 

附錄:使用組分G(NAD / NADH裂解緩沖液)的測試樣品制劑

 

1.植物細胞樣品:

用裂解緩沖液以200mg / mL均化,并以2500rpm離心5-10分鐘,使用上清液進行測試。

 

2.細菌樣品:

離心收集細菌細胞((10,000 g,0°C,15 min)。使用約1億至1千萬細胞/ mL裂解緩沖液,將處理后的溶液在室溫下保持15分鐘。以2500 rpm離心5分鐘, 用上清液進行試驗。

 

3.哺乳動物細胞樣本:

從平板孔中取出培養基,每1-5百萬個細胞使用約100μL裂解緩沖液(或在96孔細胞培養板中使用50-100μL/孔),并將處理過的溶液在室溫下保持15分鐘。 直接使用細胞裂解液或以1500 rpm離心5分鐘,使用上清液進行測試。

 

4.組織樣品:

稱取約20mg組織,用冷PBS洗滌。 在微量離心管中用400μl裂解緩沖液均化。 以2500rpm離心5-10分鐘,使用上清液進行測定。

 

參考文獻

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說明書
Amplite NADH檢測試劑盒(比色法).pdf


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