Amplite NADH檢測試劑盒(比色法)
貨號 | 15271 | 存儲條件 | 在零下15度以下保存, 避免光照 |
規格 | 400 Tests | 價格 | 3192 |
Ex (nm) | 460 | Em (nm) | |
分子量 | 溶劑 | ||
產品詳細介紹 |
簡要概述
Amplite NADH檢測試劑盒(比色法)是美國AAT Bioquest研發的檢測NADH的試劑盒,煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD +)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP +)是細胞中發現的兩種重要的輔因子。 NADH是NAD +的還原形式。 NAD形成NADP,通過酯鍵將磷酸基團添加到腺苷核苷酸的2'位置。 傳統的NAD / NADH和NADP / NADPH測定基于監測340nm處NADH或NADPH吸收的變化。 NAD / NADH和NADP / NADPH測定的短紫外波長使得傳統方法具有低靈敏度和高干擾。 AAT Bioquest的Amplite 比色NADH檢測試劑盒為檢測NADH提供了一種便捷的方法。 NADH探針是一種生色傳感器,在NADH減少時具有460nm的最大吸光度。 NADH探針的吸收與溶液中NADH的濃度成正比。 Amplite 比色NADH分析試劑盒提供靈敏的分析,可在100μL分析體積中檢測低至3μM的NADH。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商,為您提供最優質的NADH檢測試劑盒。
適用儀器
光吸收酶標儀 | |
吸收: | 460nm |
推薦孔板: | 透明底板 |
產品說明書
96孔板檢測示例
概述
準備NADH反應混合物(50μL)
加入NADH標準品或測試樣品(50μL)
在室溫下孵育持續15分鐘至2小時
監測460nm處的吸光度
注意:在開始實驗之前,在室溫下解凍每個試劑盒組分中的一個
操作步驟
1.準備NADH儲備溶液:
將200μLPBS緩沖液加入到NADH標準品(組分C)的小瓶中以制備1mM(1nmol / L)NADH儲備溶液。
注意:未使用的NADH儲備溶液應分成單次使用的等分試樣并儲存在-20℃。
2.準備NADH反應混合物:
將1mL NADH探針(組分A)加入4mL NADH測定緩沖液(組分B)中,并充分混合。
注意:5mL NADH反應混合物用于一個96孔。未使用的NADH反應混合物應分成單次使用的等分試樣并儲存在-20℃。
3.準備NADH標準品的系列稀釋液(0至100μM):
3.1將100μL的NADH儲備溶液(來自步驟1)加入到400μLPBS緩沖液(pH 7.4)中,以產生200μM(100pmol / L)NADH標準溶液。 注意:稀釋的NADH標準溶液不穩定,應在4小時內使用。
3.2取200μL的200μMNADH標準溶液進行1:2連續稀釋,得到NADH標準品的100,50,25,12.5,6.25,3.13和0μM連續稀釋液。
3.3如表1和2所述,將NADH標準品和含有NADH的測試樣品的系列稀釋液加入白色/透明底96孔板中。
注意:根據需要制備細胞或組織樣品。
表1.白色/透明底96孔微孔板中NADH標準品和測試樣品的布局
BL |
BL |
TS |
TS |
NS1 |
NS1 |
…. |
…. |
NS2 |
NS2 |
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NS3 |
NS3 |
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NS4 |
NS4 |
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NS5 |
NS5 |
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NS6 |
NS6 |
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NS7 |
NS7 |
|
注意:NS = NADH標準,BL =空白對照,TS =測試樣品。
表2.每個孔的試劑
孔 | 體積 | 試劑 |
NS1 - NS7 | 50 µL | 連續稀釋 (3.13 to 200 µM) |
BL | 50 µL | PBS |
TS | 50 µL | 測試樣品 |
*注意:將連續稀釋的NADH標準品(3.13μM至200μM)加入NS1至NS7的孔中,一式兩份。
4.在上清液反應中運行NADH測定:
4.1將50μL的NADH反應混合物(來自步驟2)加入NADH標準品,空白對照和測試樣品的每個孔中(參見步驟3.3),使總NADH測定體積為100μL/孔
注意1:對于384孔板,每孔加入25μL樣品和25μLNADH反應混合物。
注意2:根據需要準備細胞或組織樣本。 為方便起見,裂解緩沖液(組分D)可用于裂解細胞。(詳見附錄)。
4.2在室溫下孵育反應15分鐘至2小時,避光。
4.3用吸光度讀板儀在460 nm處檢測吸光度的增加。
數據分析
空白孔中的吸光度(僅用PBS緩沖液)用作對照,并從具有NADH反應的那些孔的值中減去。 NADH標準曲線如圖1所示。
圖1。 使用SpectraMax酶標儀(Molecular devices),在96孔白色/透明底板中用Amplite ™比色NADH測定試劑盒測量NADH劑量反應。 孵育30分鐘(n = 3)可以檢測到低至3μM的NADH,在460nm處測量吸光度。
附錄:使用組分G(NAD / NADH裂解緩沖液)的測試樣品制劑
1.植物細胞樣品:
用裂解緩沖液以200mg / mL均化,并以2500rpm離心5-10分鐘,使用上清液進行測試。
2.細菌樣品:
離心收集細菌細胞((10,000 g,0°C,15 min)。使用約1億至1千萬細胞/ mL裂解緩沖液,將處理后的溶液在室溫下保持15分鐘。以2500 rpm離心5分鐘, 用上清液進行試驗。
3.哺乳動物細胞樣本:
從平板孔中取出培養基,每1-5百萬個細胞使用約100μL裂解緩沖液(或在96孔細胞培養板中使用50-100μL/孔),并將處理過的溶液在室溫下保持15分鐘。 直接使用細胞裂解液或以1500 rpm離心5分鐘,使用上清液進行測試。
4.組織樣品:
稱取約20mg組織,用冷PBS洗滌。 在微量離心管中用400μl裂解緩沖液均化。 以2500rpm離心5-10分鐘,使用上清液進行測定。
參考文獻
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