mFluor Blue 570琥珀酰亞胺酯

mFluor Blue 570琥珀酰亞胺酯是美國AAT Bioquest生產的熒光標記染料，mFluor 染料是一系列優秀的熒光標記染料，可以覆蓋整個可見光譜。所有mFluor 染料都具有出色的水溶性和大的斯托克斯移位。它們的親水性使有機溶劑的使用最小化。mFluor 染料主要用于標記多色流式細胞儀應用的抗體。

琥珀酰亞胺基（NHS）酯被證明是用于胺修飾的最佳試劑，因為形成的酰胺鍵基本上與天然肽鍵相同并且穩定。這些試劑通常是穩定的并且與脂族胺表現出良好的反應性和選擇性。當琥珀酰亞胺酯化合物用于綴合反應時，需要考慮的因素很少：1）溶劑：在大多數情況下，活性染料應溶于無水二甲基甲酰胺（DMF）或二甲基亞砜（DMSO）中。 2）反應pH：胺與琥珀酰亞胺酯的標記反應強烈依賴于pH。胺反應性試劑與非質子化脂族胺基團反應，包括蛋白質的末端胺和賴氨酸的β-氨基。因此，胺?；磻ǔＴ趐H 7.5以上進行。通過琥珀酰亞胺酯進行的蛋白質修飾通?？梢栽趐H 8.5-9.5下進行。 3）反應緩沖液：當使用胺反應試劑時，必須避免使用含有游離胺如Tris和甘氨酸和硫醇化合物的緩沖液。在進行染料結合之前，還必須除去廣泛用于蛋白質沉淀的銨鹽（例如硫酸銨和乙酸銨）（例如通過透析）。 4）反應溫度：大多數綴合在室溫下進行。然而，對于特定的標記反應，可能需要升高或降低的溫度。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商，為您提供最優質的mFluor Blue 570琥珀酰亞胺酯。 

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操作方法

注意：該標記方案是針對山羊抗小鼠IgG與mFluor 450 SE的綴合物開發的。 您需根據您的實際情況而定。

1.準備蛋白質儲備溶液（溶液A）：

將100μL反應緩沖液（如1 M碳酸鈉溶液或1 M磷酸鹽緩沖液，pH~9.0）與900μL目標蛋白溶液（如抗體，蛋白質濃度> 2 mg / ml）混合至100μL，以得到1 mL蛋白質標記原液。

注1：蛋白質溶液（溶液A）的pH值應為8.5±0.5。如果蛋白質溶液的pH低于8.0，則使用1M碳酸氫鈉溶液或1M pH 9.0磷酸鹽緩沖液將pH調節至8.0-9.0的范圍。

注2：蛋白質應溶解于pH7.2-7.4的1X磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中。如果蛋白質溶解在Tris或甘氨酸緩沖液中，則必須用pH7.2-7.4的1X PBS透析，以除去用于蛋白質沉淀的游離胺或銨鹽（例如硫酸銨和乙酸銨）。

注3：不純的抗體、穩定的牛血清蛋白（BSA）抗體或明膠不會被很好的標記，疊氮化鈉或硫柳汞的存在也可能干擾綴合反應?？梢酝ㄟ^透析或旋轉柱除去疊氮化鈉或硫柳汞，以獲得極佳標記結果。

注4：如果蛋白質濃度低于2 mg / mL，則結合效率會顯著降低。為獲得極佳標記效率，建議最終蛋白質濃度范圍為2-10 mg / mL。

2.準備染料儲備溶液（溶液B）：

將無水DMSO加入到iFluor 染料SE小瓶中以制備10-20mM儲備溶液。 通過移液或渦旋混合均勻。

注意：在開始綴合前準備染料儲備溶液（溶液B），及時使用。 染料儲備溶液的長期儲存可降低染料活性。 溶液B可在冰箱中保存兩周，避光保存。 避免凍融循環。

3.確定最佳染料/蛋白質比例（可選）：

注意：每種蛋白質都需要不同的染料/蛋白質比例，這也取決于染料的性質。蛋白質的過度標記可能影響其結合親和力，而低染料/蛋白質比率的蛋白質綴合物會降低靈敏度。我們建議您通過使用連續不同量的標記染料溶液重復步驟4和5來實驗確定最佳染料/蛋白質比率。通常，對于大多數染料 - 蛋白質綴合物，推薦使用4-6種染料/蛋白質。

3.1使用10：1摩爾比的溶液B（染料）/溶液A（蛋白質）作為起始點：將5μl染料儲備溶液（溶液B，假設染料儲備溶液為10 mM）加入到樣品瓶中。蛋白質溶液（95μl溶液A）有效搖動。假設蛋白質濃度為10mg / mL并且蛋白質的分子量為~200KD，蛋白質的濃度為~0.05mM。

注意：蛋白質溶液中DMSO的濃度應<10％。

3.2運行綴合反應（參見下面的步驟4）。

3.3重復＃3.2，溶液B /溶液A的摩爾比為5：1;分別為15：1和20：1。

3.4使用預制的旋轉柱純化所需的綴合物。

3.5計算上述4種結合物的染料/蛋白質比（DOS）。

3.6檢測上述4種結合物，確定最佳的染料/蛋白質比例，以擴大標記反應。

4.運行結合反應：

4.1有效加入適量的染料儲備溶液（溶液B）到蛋白質溶液（溶液A）的小瓶中晃動。

注意：溶液B /溶液的最佳摩爾比由步驟3.6確定。如果跳過步驟3，我們建議使用10：1溶液B（染料）/溶液A（蛋白質）的摩爾比。

4.2繼續在室溫下旋轉或搖動反應混合物30-60分鐘。

5.純化綴合物

以下方案是使用Sephadex G-25柱純化染料 - 蛋白質綴合物的實例。

5.1按照說明書準備Sephadex G-25色譜柱。

5.2將反應混合物（直接從步驟4）加載到Sephadex G-25柱的頂部。

5.3樣品在頂部樹脂表面下方運行時立即加入PBS（pH 7.2-7.4）。

5.4向所需樣品中加入更多PBS（pH 7.2-7.4）以完成色譜柱純化。

注1：立即使用時，染料 - 蛋白質偶聯物需要用染色緩沖液稀釋，并等分多次使用。

注2：對于長期儲存，染料 - 蛋白質綴合物溶液需要濃縮或冷凍干燥。

參考文獻

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Suramin inhibits cullin-RING E3 ubiquitin ligases
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