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iFluor 647馬來酰亞胺

貨號1065存儲條件 在零下15度以下保存, 避免光照
規格1 mg價格2544
Ex (nm)656Em (nm)670
分子量1211.35溶劑DMSO
產品詳細介紹


簡要概述

iFluor 647馬來酰亞胺是美國AAT Bioquest生產的優秀的熒光標記染料,iFluor 染料是一系列優秀的熒光標記染料,可以覆蓋整個可見光譜。所有iFluor 染料都具有優異的水溶性。它們的親水性使有機溶劑的使用極小化。iFluor 染料也具有比經典熒光標記染料更好的標記性能,如FITC,TRITC,Texas Red ,Cy3 ,Cy5和Cy7。一些iFluor 染料在某些抗體上明顯優于Alexa Fluor 標記染料。它們是用于標記蛋白質和核酸而不包含性能的極便宜的熒光染料(替代Alexa Fluor 染料)。每種iFluor染料的開發都與特定的Alexa Fluor 或其他標記染料(如DyLight 染料)的光譜特性相匹配。

琥珀酰亞胺基(NHS)酯被證明是用于胺修飾的極佳試劑,因為形成的酰胺鍵基本上與天然肽鍵相同并且穩定。這些試劑通常是穩定的并且與脂族胺顯示出良好的反應性和選擇性。當琥珀酰亞胺酯化合物用于綴合反應時,需要考慮的因素很少:1)溶劑:在大多數情況下,活性染料應溶于無水二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基亞砜(DMSO)中。 2)反應pH:胺與琥珀酰亞胺酯的標記反應強烈依賴于pH。胺反應性試劑與非質子化脂族胺基團反應,包括蛋白質的末端胺和賴氨酸的β-氨基。因此,胺?;磻ǔT趐H 7.5以上進行。通過琥珀酰亞胺酯進行的蛋白質修飾通??梢栽趐H 8.5-9.5下進行。 3)反應緩沖液:使用胺反應試劑時,必須避免使用含有游離胺(如Tris和甘氨酸)和硫醇化合物的緩沖液。廣泛用于蛋白質沉淀的銨鹽(例如硫酸銨和乙酸銨)也必須在進行染料綴合之前除去(例如通過透析)。 4)反應溫度:大多數綴合在室溫下進行。然而,特定標記反應可能需要升高或降低的溫度。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商,為您提供最優質的iFluor 647馬來酰亞胺檢測試劑。 

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產品說明書

染色樣本分析

操作步驟

1.準備蛋白質儲備溶液(溶液A):

將100μL反應緩沖液(如1 M碳酸鈉溶液或1 M磷酸鹽緩沖液,pH~9.0)與900μL目標蛋白溶液(如抗體,蛋白質濃度> 2 mg / ml,如果可能)混合至100μL給予1 mL蛋白質標記原液。

注1:蛋白質溶液(溶液A)的pH值應為8.5±0.5。如果蛋白質溶液的pH低于8.0,則使用1M碳酸氫鈉溶液或1M pH 9.0磷酸鹽緩沖液將pH調節至8.0-9.0的范圍。

注2:蛋白質應溶解于pH7.2-7.4的1X磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中。如果蛋白質溶解在Tris或甘氨酸緩沖液中,則必須用pH7.2-7.4的1X PBS透析,以除去廣泛用于蛋白質沉淀的游離胺或銨鹽(例如硫酸銨和乙酸銨)。

注3:不純的抗體、穩定的牛血清蛋白(BSA)抗體或明膠不會被很好的標記。疊氮化鈉或硫柳汞的存在也可能干擾綴合反應??梢酝ㄟ^透析或旋轉柱除去疊氮化鈉或硫柳汞,以獲得極佳標記結果。

注4:如果蛋白質濃度低于2 mg / mL,則結合效率會顯著降低。為獲得極佳標記效率,建議極終蛋白質濃度范圍為2-10 mg / mL。

 

2.準備染料儲備溶液(溶液B):

將無水DMSO加入到iFluor 染料SE小瓶中以制備10-20mM儲備溶液。 通過移液或渦旋混合均勻。

注意:在開始綴合前準備染料儲備溶液(溶液B)。 及時使用。 染料儲備溶液的長期儲存可降低染料活性。 溶液B可在冰箱中保存兩周,避光保存。 避免凍融循環。

 

3.確定極佳染料/蛋白質比例(可選):

注意:每種蛋白質都需要不同的染料/蛋白質比例,這也取決于染料的性質。蛋白質的過度標記可能不利地影響其結合親和力,而低染料/蛋白質比率的蛋白質綴合物會降低靈敏度。我們建議您通過使用連續不同量的標記染料溶液重復步驟4和5來實驗確定極佳染料/蛋白質比率。通常,對于大多數染料 - 蛋白質綴合物,推薦使用4-6種染料/蛋白質。

3.1使用10:1摩爾比的溶液B(染料)/溶液A(蛋白質)作為起始點:將5μl染料儲備溶液(溶液B,假設染料儲備溶液為10 mM)加入到樣品瓶中。蛋白質溶液(95μl溶液A)有效搖動。假設蛋白質濃度為10mg / mL并且蛋白質的分子量為~200KD,蛋白質的濃度為~0.05mM。

注意:蛋白質溶液中DMSO的濃度應<10%。

3.2運行綴合反應(參見下面的步驟4)。

3.3重復#3.2,溶液B /溶液A的摩爾比為5:1;分別為15:1和20:1。

3.4使用預制的旋轉柱純化所需的綴合物。

3.5計算上述4種結合物的染料/蛋白質比(DOS)(見說明書)。

3.6運行上述4種結合物的功能測試,確定極佳的染料/蛋白質比例,以擴大標記反應。

 

4.運行結合反應:

4.1有效加入適量的染料儲備溶液(溶液B)到蛋白質溶液(溶液A)的小瓶中晃動。

注意:溶液B /溶液的極佳摩爾比由步驟3.6確定。如果跳過步驟3,我們建議使用10:1溶液B(染料)/溶液A(蛋白質)的摩爾比。

4.2繼續在室溫下旋轉或搖動反應混合物30-60分鐘。

 

5.純化綴合物

以下方案是使用Sephadex G-25柱純化染料 - 蛋白質綴合物的實例。

5.1按照制造說明準備Sephadex G-25色譜柱。

5.2將反應混合物(直接從步驟4)加載到Sephadex G-25柱的頂部。

5.3樣品在頂部樹脂表面下方運行時立即加入PBS(pH 7.2-7.4)。

5.4向所需樣品中加入更多PBS(pH 7.2-7.4)以完成色譜柱純化。 合并含有所需染料 - 蛋白質綴合物的級分。

注1:立即使用時,染料 - 蛋白質偶聯物需要用染色緩沖液稀釋,并等分多次使用。

注2:對于長期儲存,染料 - 蛋白質綴合物溶液需要濃縮或冷凍干燥

 

參考文獻

Deep Sequencing Analysis of the Eha-Regulated Transcriptome of Edwardsiella tarda Following Acidification
Authors: D Gao, N Liu, Y Li, Y Zhang, G Liu
Journal: Metabolomics (Los Angel) (2017): 2153--0769

Suramin inhibits cullin-RING E3 ubiquitin ligases
Authors: Kenneth Wu, Robert A Chong, Qing Yu, Jin Bai, Donald E Spratt, Kevin Ching, Chan Lee, Haibin Miao, Inger Tappin, Jerard Hurwitz
Journal: Proceedings of the National Academy of Sciences (2016): E2011--E2018

Glycosaminoglycan mimicry by COAM reduces melanoma growth through chemokine induction and function
Authors: Helene Piccard, Nele Berghmans, Eva Korpos, Chris Dillen, Ilse Van Aelst, Sandra Li, Erik Martens, Sandra Liekens, Sam Noppen, Jo Van Damme
Journal: International Journal of Cancer (2012): E425--E436

 

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產品名稱 貨號
iFluor 647琥珀酰亞胺酯 Cat#1031
iFluor 647疊氮化物 Cat#1091
iFluor 647 胺 Cat#1074


說明書
iFluor 647馬來酰亞胺.pdf


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