iFluor 514琥珀酰亞胺酯
 | 貨號 | 1024 | 存儲條件 | 在零下15度以下保存, 避免光照 |
| 規格 | 1 mg | 價格 | 2544 | |
| Ex (nm) | 528 | Em (nm) | 555 | |
| 分子量 | 1013.95 | 溶劑 | DMSO | |
| 產品詳細介紹 | ||||
簡要概述
iFluor 514琥珀酰亞胺酯是iFluor系列熒光標記染料之一，可以覆蓋整個可見光譜。所有iFluor 染料都具有優異的水溶性。它們的親水性使有機溶劑的使用極小化。iFluor 染料也具有比經典熒光標記染料更好的標記性能，如FITC，TRITC，Texas Red ，Cy3 ，Cy5和Cy7。一些iFluor 染料在某些抗體上明顯優于Alexa Fluor 標記染料。它們是用于標記蛋白質和核酸而不包含性能的極便宜的熒光染料（替代Alexa Fluor 染料）。每種iFluor染料的開發都與特定的Alexa Fluor 或其他標記染料（如DyLight 染料）的光譜特性相匹配。
琥珀酰亞胺基（NHS）酯被證明是用于胺修飾的極佳試劑，因為形成的酰胺鍵基本上與天然肽鍵相同并且穩定。這些試劑通常是穩定的并且與脂族胺顯示出良好的反應性和選擇性。當琥珀酰亞胺酯化合物用于綴合反應時，需要考慮的因素很少：1.溶劑：在大多數情況下，活性染料應溶于無水二甲基甲酰胺（DMF）或二甲基亞砜（DMSO）中。 2.反應pH：胺與琥珀酰亞胺酯的標記反應強烈依賴于pH。胺反應性試劑與非質子化脂族胺基團反應，包括蛋白質的末端胺和賴氨酸的β-氨基。因此，胺?；磻ǔＴ趐H 7.5以上進行。通過琥珀酰亞胺酯進行的蛋白質修飾通?？梢栽趐H 8.5-9.5下進行。 3.反應緩沖液：使用胺反應試劑時，必須避免使用含有游離胺（如Tris和甘氨酸）和硫醇化合物的緩沖液。廣泛用于蛋白質沉淀的銨鹽（例如硫酸銨和乙酸銨）也必須在進行染料綴合之前除去（例如通過透析）。 4.反應溫度：大多數綴合在室溫下進行。特定標記反應可能需要升高或降低的溫度。iFluor系列染料是AF系列染料的完美替代品。
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產品說明書
染色樣本分析
操作步驟
1.準備蛋白質儲備溶液（溶液A）：
將100μL反應緩沖液（如1 M碳酸鈉溶液或1 M磷酸鹽緩沖液，pH~9.0）與900μL目標蛋白溶液（如抗體，蛋白質濃度> 2 mg / ml，如果可能）混合至100μL給予1 mL蛋白質標記原液。
注1：蛋白質溶液（溶液A）的pH值應為8.5±0.5。如果蛋白質溶液的pH低于8.0，則使用1M碳酸氫鈉溶液或1M pH 9.0磷酸鹽緩沖液將pH調節至8.0-9.0的范圍。
注2：蛋白質應溶解于pH7.2-7.4的1X磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中。如果蛋白質溶解在Tris或甘氨酸緩沖液中，則必須用pH7.2-7.4的1X PBS透析，以除去廣泛用于蛋白質沉淀的游離胺或銨鹽（例如硫酸銨和乙酸銨）。
注3：不純的抗體、穩定的牛血清蛋白（BSA）抗體或明膠不會被很好的標記。疊氮化鈉或硫柳汞的存在也可能干擾綴合反應?？梢酝ㄟ^透析或旋轉柱除去疊氮化鈉或硫柳汞，以獲得極佳標記結果。
注4：如果蛋白質濃度低于2 mg / mL，則結合效率會顯著降低。為獲得極佳標記效率，建議極終蛋白質濃度范圍為2-10 mg / mL。
2.準備染料儲備溶液（溶液B）：
將無水DMSO加入到iFluor 染料SE小瓶中以制備10-20mM儲備溶液。 通過移液或渦旋混合均勻。
注意：在開始綴合前準備染料儲備溶液（溶液B）。 及時使用。 染料儲備溶液的長期儲存可降低染料活性。 溶液B可在冰箱中保存兩周，避光保存。 避免凍融循環。
3.確定極佳染料/蛋白質比例（可選）：
注意：每種蛋白質都需要不同的染料/蛋白質比例，這也取決于染料的性質。蛋白質的過度標記可能不利地影響其結合親和力，而低染料/蛋白質比率的蛋白質綴合物會降低靈敏度。我們建議您通過使用連續不同量的標記染料溶液重復步驟4和5來實驗確定極佳染料/蛋白質比率。通常，對于大多數染料 - 蛋白質綴合物，推薦使用4-6種染料/蛋白質。
3.1使用10：1摩爾比的溶液B（染料）/溶液A（蛋白質）作為起始點：將5μl染料儲備溶液（溶液B，假設染料儲備溶液為10 mM）加入到樣品瓶中。蛋白質溶液（95μl溶液A）有效搖動。假設蛋白質濃度為10mg / mL并且蛋白質的分子量為~200KD，蛋白質的濃度為~0.05mM。
注意：蛋白質溶液中DMSO的濃度應<10％。
3.2運行綴合反應（參見下面的步驟4）。
3.3重復＃3.2，溶液B /溶液A的摩爾比為5：1;分別為15：1和20：1。
3.4使用預制的旋轉柱純化所需的綴合物。
3.5計算上述4種結合物的染料/蛋白質比（DOS）（見說明書）。
3.6運行上述4種結合物的功能測試，確定極佳的染料/蛋白質比例，以擴大標記反應。
4.運行結合反應：
4.1有效加入適量的染料儲備溶液（溶液B）到蛋白質溶液（溶液A）的小瓶中晃動。
注意：溶液B /溶液的極佳摩爾比由步驟3.6確定。如果跳過步驟3，我們建議使用10：1溶液B（染料）/溶液A（蛋白質）的摩爾比。
4.2繼續在室溫下旋轉或搖動反應混合物30-60分鐘。
5.純化綴合物
以下方案是使用Sephadex G-25柱純化染料 - 蛋白質綴合物的實例。
5.1按照制造說明準備Sephadex G-25色譜柱。
5.2將反應混合物（直接從步驟4）加載到Sephadex G-25柱的頂部。
5.3樣品在頂部樹脂表面下方運行時立即加入PBS（pH 7.2-7.4）。
5.4向所需樣品中加入更多PBS（pH 7.2-7.4）以完成色譜柱純化。 合并含有所需染料 - 蛋白質綴合物的級分。
注1：立即使用時，染料 - 蛋白質偶聯物需要用染色緩沖液稀釋，并等分多次使用。
注2：對于長期儲存，染料 - 蛋白質綴合物溶液需要濃縮或冷凍干燥
參考文獻
Deep Sequencing Analysis of the Eha-Regulated Transcriptome of Edwardsiella tarda Following Acidification
Authors: D Gao, N Liu, Y Li, Y Zhang, G Liu
Journal: Metabolomics (Los Angel) (2017): 2153--0769
Suramin inhibits cullin-RING E3 ubiquitin ligases
Authors: Kenneth Wu, Robert A Chong, Qing Yu, Jin Bai, Donald E Spratt, Kevin Ching, Chan Lee, Haibin Miao, Inger Tappin, Jerard Hurwitz
Journal: Proceedings of the National Academy of Sciences (2016): E2011--E2018
Glycosaminoglycan mimicry by COAM reduces melanoma growth through chemokine induction and function
Authors: Helene Piccard, Nele Berghmans, Eva Korpos, Chris Dillen, Ilse Van Aelst, Sandra Li, Erik Martens, Sandra Liekens, Sam Noppen, Jo Van Damme
Journal: International Journal of Cancer (2012): E425--E436
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