iFluor 514琥珀酰亞胺酯
![]() | 貨號 | 1024 | 存儲條件 | 在零下15度以下保存, 避免光照 |
規格 | 1 mg | 價格 | 2544 | |
Ex (nm) | 528 | Em (nm) | 555 | |
分子量 | 1013.95 | 溶劑 | DMSO | |
產品詳細介紹 |
簡要概述
iFluor 514琥珀酰亞胺酯是iFluor系列熒光標記染料之一,可以覆蓋整個可見光譜。所有iFluor 染料都具有優異的水溶性。它們的親水性使有機溶劑的使用極小化。iFluor 染料也具有比經典熒光標記染料更好的標記性能,如FITC,TRITC,Texas Red ,Cy3 ,Cy5和Cy7。一些iFluor 染料在某些抗體上明顯優于Alexa Fluor 標記染料。它們是用于標記蛋白質和核酸而不包含性能的極便宜的熒光染料(替代Alexa Fluor 染料)。每種iFluor染料的開發都與特定的Alexa Fluor 或其他標記染料(如DyLight 染料)的光譜特性相匹配。
琥珀酰亞胺基(NHS)酯被證明是用于胺修飾的極佳試劑,因為形成的酰胺鍵基本上與天然肽鍵相同并且穩定。這些試劑通常是穩定的并且與脂族胺顯示出良好的反應性和選擇性。當琥珀酰亞胺酯化合物用于綴合反應時,需要考慮的因素很少:1.溶劑:在大多數情況下,活性染料應溶于無水二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基亞砜(DMSO)中。 2.反應pH:胺與琥珀酰亞胺酯的標記反應強烈依賴于pH。胺反應性試劑與非質子化脂族胺基團反應,包括蛋白質的末端胺和賴氨酸的β-氨基。因此,胺?;磻ǔT趐H 7.5以上進行。通過琥珀酰亞胺酯進行的蛋白質修飾通??梢栽趐H 8.5-9.5下進行。 3.反應緩沖液:使用胺反應試劑時,必須避免使用含有游離胺(如Tris和甘氨酸)和硫醇化合物的緩沖液。廣泛用于蛋白質沉淀的銨鹽(例如硫酸銨和乙酸銨)也必須在進行染料綴合之前除去(例如通過透析)。 4.反應溫度:大多數綴合在室溫下進行。特定標記反應可能需要升高或降低的溫度。iFluor系列染料是AF系列染料的完美替代品。
產品說明書
染色樣本分析
操作步驟
1.準備蛋白質儲備溶液(溶液A):
將100μL反應緩沖液(如1 M碳酸鈉溶液或1 M磷酸鹽緩沖液,pH~9.0)與900μL目標蛋白溶液(如抗體,蛋白質濃度> 2 mg / ml,如果可能)混合至100μL給予1 mL蛋白質標記原液。
注1:蛋白質溶液(溶液A)的pH值應為8.5±0.5。如果蛋白質溶液的pH低于8.0,則使用1M碳酸氫鈉溶液或1M pH 9.0磷酸鹽緩沖液將pH調節至8.0-9.0的范圍。
注2:蛋白質應溶解于pH7.2-7.4的1X磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中。如果蛋白質溶解在Tris或甘氨酸緩沖液中,則必須用pH7.2-7.4的1X PBS透析,以除去廣泛用于蛋白質沉淀的游離胺或銨鹽(例如硫酸銨和乙酸銨)。
注3:不純的抗體、穩定的牛血清蛋白(BSA)抗體或明膠不會被很好的標記。疊氮化鈉或硫柳汞的存在也可能干擾綴合反應??梢酝ㄟ^透析或旋轉柱除去疊氮化鈉或硫柳汞,以獲得極佳標記結果。
注4:如果蛋白質濃度低于2 mg / mL,則結合效率會顯著降低。為獲得極佳標記效率,建議極終蛋白質濃度范圍為2-10 mg / mL。
2.準備染料儲備溶液(溶液B):
將無水DMSO加入到iFluor 染料SE小瓶中以制備10-20mM儲備溶液。 通過移液或渦旋混合均勻。
注意:在開始綴合前準備染料儲備溶液(溶液B)。 及時使用。 染料儲備溶液的長期儲存可降低染料活性。 溶液B可在冰箱中保存兩周,避光保存。 避免凍融循環。
3.確定極佳染料/蛋白質比例(可選):
注意:每種蛋白質都需要不同的染料/蛋白質比例,這也取決于染料的性質。蛋白質的過度標記可能不利地影響其結合親和力,而低染料/蛋白質比率的蛋白質綴合物會降低靈敏度。我們建議您通過使用連續不同量的標記染料溶液重復步驟4和5來實驗確定極佳染料/蛋白質比率。通常,對于大多數染料 - 蛋白質綴合物,推薦使用4-6種染料/蛋白質。
3.1使用10:1摩爾比的溶液B(染料)/溶液A(蛋白質)作為起始點:將5μl染料儲備溶液(溶液B,假設染料儲備溶液為10 mM)加入到樣品瓶中。蛋白質溶液(95μl溶液A)有效搖動。假設蛋白質濃度為10mg / mL并且蛋白質的分子量為~200KD,蛋白質的濃度為~0.05mM。
注意:蛋白質溶液中DMSO的濃度應<10%。
3.2運行綴合反應(參見下面的步驟4)。
3.3重復#3.2,溶液B /溶液A的摩爾比為5:1;分別為15:1和20:1。
3.4使用預制的旋轉柱純化所需的綴合物。
3.5計算上述4種結合物的染料/蛋白質比(DOS)(見說明書)。
3.6運行上述4種結合物的功能測試,確定極佳的染料/蛋白質比例,以擴大標記反應。
4.運行結合反應:
4.1有效加入適量的染料儲備溶液(溶液B)到蛋白質溶液(溶液A)的小瓶中晃動。
注意:溶液B /溶液的極佳摩爾比由步驟3.6確定。如果跳過步驟3,我們建議使用10:1溶液B(染料)/溶液A(蛋白質)的摩爾比。
4.2繼續在室溫下旋轉或搖動反應混合物30-60分鐘。
5.純化綴合物
以下方案是使用Sephadex G-25柱純化染料 - 蛋白質綴合物的實例。
5.1按照制造說明準備Sephadex G-25色譜柱。
5.2將反應混合物(直接從步驟4)加載到Sephadex G-25柱的頂部。
5.3樣品在頂部樹脂表面下方運行時立即加入PBS(pH 7.2-7.4)。
5.4向所需樣品中加入更多PBS(pH 7.2-7.4)以完成色譜柱純化。 合并含有所需染料 - 蛋白質綴合物的級分。
注1:立即使用時,染料 - 蛋白質偶聯物需要用染色緩沖液稀釋,并等分多次使用。
注2:對于長期儲存,染料 - 蛋白質綴合物溶液需要濃縮或冷凍干燥
參考文獻
Deep Sequencing Analysis of the Eha-Regulated Transcriptome of Edwardsiella tarda Following Acidification
Authors: D Gao, N Liu, Y Li, Y Zhang, G Liu
Journal: Metabolomics (Los Angel) (2017): 2153--0769
Suramin inhibits cullin-RING E3 ubiquitin ligases
Authors: Kenneth Wu, Robert A Chong, Qing Yu, Jin Bai, Donald E Spratt, Kevin Ching, Chan Lee, Haibin Miao, Inger Tappin, Jerard Hurwitz
Journal: Proceedings of the National Academy of Sciences (2016): E2011--E2018
Glycosaminoglycan mimicry by COAM reduces melanoma growth through chemokine induction and function
Authors: Helene Piccard, Nele Berghmans, Eva Korpos, Chris Dillen, Ilse Van Aelst, Sandra Li, Erik Martens, Sandra Liekens, Sam Noppen, Jo Van Damme
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