Amplite 熒光法谷胱甘肽GSH/GSSG比率檢測試劑盒 綠色熒光

Amplite 熒光法谷胱甘肽GSH/GSSG比率檢測試劑盒 綠色熒光是美國AAT Bioquest生產的用于檢測GSH/GSSG比率的試劑盒，谷胱甘肽是一種含有L-半胱氨酸，L-谷氨酸和甘氨酸的三肽。它是細胞中最小的細胞內蛋白質硫醇分子，可防止由活性氧如自由基和過氧化物引起的細胞損傷。谷胱甘肽以還原（GSH）和氧化（GSSG）狀態存在。還原型谷胱甘肽（GSH）是一種主要的組織抗氧化劑，其為谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）催化的脂質氫過氧化物還原為其相應的醇和過氧化氫還原為水提供還原當量。在GPx催化反應中，兩個GSH分子之間形成二硫鍵產生氧化型谷胱甘肽（GSSG）。谷胱甘肽還原酶（GR）將GSSG再循環到GSH，同時氧化β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（β-NADPH2）。在健康細胞中，超過90％的谷胱甘肽總量為還原型（GSH）。當細胞暴露于增加的氧化應激水平時，GSSG積累并且GSSG與GSH的比例增加。 GSSG-GSH比例增加是氧化應激的指標。監測生物樣品中還原和氧化的GSH對于評估細胞和組織對氧化和自由基介導的細胞損傷的氧化還原和解毒狀態是必不可少的。

有很多試劑或檢測試劑盒可用于定量生物系統中的硫醇。但是，大多數市場上的試劑盒都缺乏靈敏度或者含有繁瑣操作。我們的Amplite 熒光谷胱甘肽GSH / GSSG比值分析試劑盒提供了一種超靈敏的分析方法，可定量分析樣品中的GSH。該試劑盒使用專有的非熒光染料，與GSH反應后變為強熒光。使用一步熒光法，該試劑盒可在100μL測定體積（10 nM）中檢測少至1皮摩爾的GSH或GSSG。該測定可以在96孔或384孔微量滴定板下進行實驗，并且容易適應自動化而無需分離步驟。其信號可通過熒光酶標儀在Ex / Em = 490 / 520nm處輕松讀取。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商，為您提供最優質的NADP/NADPH檢測試劑盒。 

96孔板測定示例（100個測試）

概述

準備Thiolite 綠色反應混合物（50μL）

添加GSH標準品和/或GSSG標準品或測試樣品（50μL）

在室溫下孵育10至60分鐘監測Ex / Em = 490/520 nm處的熒光增加

注意：在開始實驗之前，在室溫下解凍所有試劑盒組分。

操作方法

1.準備GSH標準儲備液：

將200μL測定緩沖液（組分B）加入到GSH標準品（組分C）的小瓶中以制備1mM（1nmol / L）GSH標準儲備溶液。

注意：未使用的GSH標準儲備溶液應分成單次使用的等分試樣并儲存在-20℃。

2.準備GSSG標準庫存解決方案：

將200μlddH2O加入到GSSG標準品（組分F）的小瓶中以制備1mM（1nmol / L）GSSG標準儲備溶液。

注意：未使用的GSSG標準儲備溶液應分成單次使用的等分試樣并儲存在-20℃。

3.準備100X Thiolite Green原液：

將100μLDMSO（組分D）加入小瓶硫醇石綠（組分A）中以制備100X Thiolite Green原液。

注意：未使用的Thiolite Green原液應分成單次使用的等分試樣，保存在-20℃，避免光照。

4.準備GSH分析混合物（GAM）：

將100μL100XThiolite Green原液（來自步驟3）加入10mL測定緩沖液（組分B）中，并通過渦旋充分混合。

注1：該GSH測定混合物（GAM）足以用于兩個96孔板。在室溫下不穩定，應在2小時內及時使用，避免暴露在光線下。

注2：或者，可以通過按比例添加含有分析緩沖液的100X Thiolite Green原液來制備GSH分析混合物。

5.準備總GSH分析混合物（TGAM）：

將5mL GAM（來自步驟4）加入GSSG探針（組分E）瓶中，并充分混合。

注1：該總GSH測定混合物（TGAM）足以用于一個96孔板。在室溫下不穩定，應在2小時內及時使用，避免暴露在光線下。

注2：或者，可以通過向組分E的瓶中加入200μL的ddH2O制備25X GSSG探針，然后通過按比例混合儲備溶液與GAM（來自步驟4）來制備TGAM測定混合物。將未使用的25X GSSG探針儲備液等分并保存在-20℃，避免凍融循環。

6.準備連續稀釋的GSH標準品（0至5μM）：

6.1將10μL的GSH標準儲備溶液（來自步驟1）加入到990L的測定緩沖液（組分B）中以產生10M（10pmol / L）GSH標準溶液。

注意：稀釋的GSH標準溶液不穩定。 在4小時內使用。

6.2取200μL10μMGSH標準溶液進行1：2連續稀釋，得到5,2.5,1.25,0.625,0.3125,0.1563,0.0781和0μM連續稀釋的GSH標準品。

6.3如說明書中表1和表2所示，將GSH標準品和含有GSH的測試樣品加入到96孔微量培養板中。當僅需要GSH測定時，根據表1僅填充左側兩列（A組）中的孔。跳過第7步，直接進入第8步。

注意：根據需要處理細胞或組織樣本。

7.準備連續稀釋的GSSG標準品（0至5μM）：

7.1將10μLGSSG標準儲備溶液（來自步驟2）加入990L測定緩沖液（組分B）中以產生10μM（10pmol / L）GSSG標準溶液。

注意：稀釋的GSSG標準溶液不穩定。 在4小時內使用。

7.2取200μL10μMGSSG標準溶液進行1：2連續稀釋，得到5,2.5,1.25,0.625,0.3125,0.1563,0.0781和0μM連續稀釋的GSSG標準品。 總GSH標準溶液的濃度應為GSSG標準溶液濃度的兩倍，分別為10,5,2.5,1.25,0.625,0.3125,0.1563和0μM。

7.3如說明書中表1和2所示，將GSSG標準品和含有GSH的測試樣品加入到96孔微孔板中。當需要總GSH測定時，根據A組（左）和B組（右）填充孔。

注意：根據需要處理細胞或組織樣本。

8.運行GSH和總GSH測定：

8.1將50μLGSHAssay Mixture（GAM，來自步驟4）加入GSH標準的A組（左），空白對照和測試樣品（來自步驟6.3）的孔中，使總測定體積為100μL/孔。

注意：對于384孔板，每孔加入25μL樣品和25μLGSHAssay混合液。

8.2如果需要總GSH（在還原和氧化狀態下）測定，將50μL總GSH測定混合物（來自步驟5的TGAM）加入到GSSG標準，空白對照和測試樣品的B組（右）的孔中（來自 步驟6.3）使總測定體積為100μL/孔。

注意：對于384孔板，每孔加入25μL樣品和25μL總GSH分析混合物。

8.3在室溫下孵育反應10分鐘至1小時，避光。

8.4用熒光板讀數器監測Ex / Em = 490 / 520nm處的熒光增加。

參考文獻

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